苦马豆外植体初代培养杂菌污染率控制的探讨

郭 刚， 朱妍梅， 付习科， 石 强

(新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100)



苦马豆外植体初代培养杂菌污染率控制的探讨

郭 刚， 朱妍梅*， 付习科， 石 强

(新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100)

[目的]以苦马豆种子和发芽幼苗的不同部位作为外植体进行无菌处理和培养，探究杂菌污染率控制的方法。[方法]以MS 为基本培养基，通过不同消毒试剂种类和浓度配比、时间，探讨其对外植体初代培养污染率的影响。[结果] 野生苦马豆种子去皮后采用0.1%升汞消毒效果较好，消毒时间以6 min为佳；苦马豆幼苗胚轴最佳消毒时间为6 min；外植体表面灭菌后使用50 mg/L的青霉素溶液处理30 min效果最为理想。[结论]筛选获得适宜的外植体消毒方法，对细菌和真菌的抑制作用提供一条有效的途径，为提高苦马豆组培体系工厂化育苗的效率奠定基础。

苦马豆；初代培养； 外植体；污染率

苦马豆[Swainsonasalsula(Pall.) DC]隶属豆科苦马豆属植物，别名羊尿泡，属多年生草本或小乔木，我国仅有一属一种，主要分布于我国西北地区，以全草、根、果实入药，具有利尿、消肿、降压等功效[1-4]。近年来，由于过度放牧、过度农垦和不合理采集地下水资源等导致土地沙漠化，生态环境 日益恶化，植被遭到破坏，野生苦马豆数量急剧下降，苦马豆资源日趋匮乏。因此，建立苦马豆人工繁殖技术，可改变传统的繁殖系数小、用种量大、生产成本高的育苗方式，从而实现苦马豆繁育的良种化、标准化和规模化，同时能够快速供苗，降低种苗成本，提高资源利用效益，保持苦马豆资源可持续利用[5]。

在建立苦马豆快繁体系时,外植体来自田间，植物材料表面不仅附着大量微生物而且可能携带有内生菌。因此植物组织培养无菌体系的建立必须经过初代外植体消毒这个重要环节。在以苦马豆种子为基础建立外植体再生体系，对外源与内源杂菌消毒与污染控制的研究尚未见报道。为了提高苦马豆组织培养壮苗率，笔者在外植体初代筛选培养中，采用不同消毒试剂和消毒方法处理材料，并探讨抗生素是否会对外植体生长发育产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料野生苦马豆干种子(采集于新疆昌吉市六工镇田间)，经浸泡处理，剥去种皮，放于垫湿润滤纸的培养皿中，在23 ℃恒温培养箱中培养，生长至5～6 cm 幼苗，取叶柄、胚轴、子叶切段作为试验材料，开展外植体抑菌试验。

1.2 统计方法

(1)萌发率=(发芽种子数/种子总数)×100%；(2)污染率=(污染数/接种总数)×100；(3)未污染率=(未污染数/接种总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对苦马豆种子萌发的影响经1 g/L升汞与1 g/L次氯酸钠消毒处理后，发现升汞消毒效果较好，消毒时间以6 min为佳。尽管未去种皮种子在1 g/L升汞处理6 min下，污染率显著下降，但尚未完全得到无菌幼苗，即无菌体系还不能完全保证。但将种子进行去果皮处理后发现，发芽率明显提高，污染率降到最低(表1)。

2.2 不同0.1%升汞消毒时间对不同外植体的影响虽然不同外植体最佳消毒时间有所不同，但在0.1%升汞处理下，所有外植体的污染率在一定时间范围内均随消毒时间增加而降低，但消毒时间过长会造成毒害，致使外植体因损伤而死亡。从表2可以看出，采用0.1%升汞处理不同外植体，幼嫩叶柄的最佳消毒时间为5 min，当时间超过5 min时，未污染率达100%，但成活率仅为30%；胚轴最佳消毒时间为6 min，其次为5 min，而7 min时成活率仅为30%，明显下降；叶片的最佳消毒时间为5 min，其次为4 min，超过5 min将导致成活数下降，可见，当消毒时间较短时消毒效果不佳，而太长又会损坏材料，直接影响其成活。因此，在对材料进行表面消毒处理时，时间控制是关键因素。

2.3 抗生素抑菌效果采用2 种常见抗生素(庆大霉素和青霉素)研究其对初代苦马豆外植体培养中污染菌的抑制作用， 并探讨是否对苦马豆外植体生长发育产生影响。

由表3可知，在外植体表面灭菌前使用抗生素的抑菌效果并不理想，5 mg/L青霉素溶液处理24 h时，被感染的外植体数均比使用庆大霉素2个处理低。但外植体表面消毒后使用50 mg/L抗生素溶液处理30 min效果最为理想，且青霉素的抑菌效果比庆大霉素好。使用这2种处理后，在以后的继代、分化与生长过程中均未发现对植株有致毒作用，外植体发育正常。

表1 不同消毒剂处理对不同类型种子萌发率和污染率的影响 %

表2 不同0.1%升汞消毒时间对不同外植体的影响

表3 不同抗生素处理对不同外植体污染率的影响 %

3 结论与讨论

建立无菌繁殖体系，是植物组织培养的首要步骤。初代外植体筛选，表面微生物的污染一般容易控制。该试验中，苦马豆种子去种皮处理后发现,在0.1%升汞处理6 min,发芽率达到95%，样本污染率降到最低为2%，采用0.1%升汞分别处理初代外植体叶柄、胚轴、子叶5、6、5 min后，污染率和成活率均达到最佳控制状态。

在植物组织培养研究或规模化生产过程中，微生物特别是内生菌污染，是导致试管材料死亡的最主要原因。在苦马豆顶芽诱导培养试验中发现，培养2～3代后，培养基中出现“丝状物”污染，说明苦马豆带有较多的内生菌，经外植体表面灭菌后，通常很难将其杀灭，致使组织培养过程中出现较高的污染率。

目前，对内生菌防治最有效的办法是使用抗生素[6-7]。研究表明，直接在培养基中加入抗生素能有效控制这类污染，但这种处理对植物具有致毒作用并延缓其生长[8]。且长时间的使用不但会使内生菌的抗药性增强，而且会使植物对药物的依赖性加强[9]，如Leifert等[10]在培养基中加入抗生素，飞燕草的增殖和生根都受到阻缓。

该试验采用青霉素与庆大霉素2种抗生素溶液，分别在苦马豆外植体表面灭菌前和表面灭菌后使用，结果发现，抗生素溶液在表面灭菌后使用比向培养基中加入抗生素更方便，且对植物无明显的致毒作用。同时采用抗生素溶液在表面灭菌后浸泡外植体则较省时、简便，为后期外植体继代培养提供大量无菌材料奠定基础。此种处理方法与牟会斌[11]在微型月季微繁体系的构建及织培生根机理研究中所得结果相似。

植物组织培养中全部杀死植物表面和组织中的微生物，一般的消毒方法无法完成。内源菌则较难控制，目前除利用抗生素外，还可通过先对外植体植物进行预栽管理、外植体的预处理。在此基础上，改进消毒方法(如真空减压法、酸化培养基、灼烧法等)，均能降低由内源菌引起的污染[12]。

[1] 马金双.关于苦马豆属学名的讨论[J].云南植物研究，1991，13(4):380-382.

[2]王进，王桔红，张勇，等.苦豆子和苦马豆种子特性及硬实破除研究[J].中药材，2011， 34(5)：670 -673.

[3] 周吉林，伍春莲，陈卫英.光照及黑暗条件下不同浓度2，4-D 对诱导苦马豆愈伤组织的影响[J].内江师范学院学报，2009，24(12)：41 -44.

[4] 崔小蓉，刘慧，杨军.钙盐胁迫下苦马豆愈伤组织生理指标研究[J] .西华师范大学学报：自然科学版，2011，32(3)：259 -263.

[5] 郭刚，卢跃敏，张晓宏等.苦马豆的组织培养与快速繁殖[J].新疆农业科学，2014， 51(1)：118 -123.

[6] 李海航，潘瑞炽.青霉素在高等植物中的应用[J].植物生理学通讯，1987(5):1.

[7] SKIRVIN R M，CHU M C，YOUNG H J.Rose[M]//AMMIRATIOSHARP W R,EVAN S D A，BAJAJ YP S，et al.Handbook of Plant cellculture.VoI 5(ornamental species).New York:McGaw-Hill,1990:716-743.

[8] DODDS J R,ROBERTS L W.Some inhibitory effects of gentamycin on plant tissue cultures[J].In Vitro,1981,17: 467-470.

[9] FALKINER F R.Strategy for the selection of antibiotics for use against common bacterial pathogens and endophytes of plants[J].Acta Hort,1988,225:53-56.

[10] LEIFERT C,MORRIS C,WATIES W M.Effect of conmbinations of antibiotics micropropagated clematis,Delphinniu,Hosta,Iris and Photinia[J].Plant Cell Tissue Organ Culture,1992,29:153-160.

[11] 牟会斌.微型月季微繁体系的构建及组培生根机理研[D].南京：南京农业大学， 2001.

[12] 曹青爽，黄闽敏，李萍.植物组织培养中的污染控制[J].农村科技，2009(6):55-56.

Control on Bacterial Contamination ofSwainsonasalsulaExplant Cultures

GUO Gang, ZHU Yan-mei*, FU Xi-ke et al

(Xinjiang Vocational College of Agriculture, Changji,Xinjiang 831100)

[Objective] WithSwainsonasalsulaseeds and different parts of seedlings as explants, aseptic processing and culture was conducted, methods to control the rate of bacterial contamination were explored.[Method] Using MS as basic medium, through different types and concentrations of disinfection reagent ratio, time, the effects on explant primary culture contamination rate were discussed.[Result] The results showed that the seeds of wild salsula peeled with 0.1% mercuric chloride is better, better disinfection time 6 min; Explants after surface sterilized using 50 mg/L penicillin solution for 30 min has ideal treatment effect.[Conclusion] The suitable explant disinfection methods were obtained, which will provide an effective way for the inhibition of bacteria and fungi, lay the foundation for improving the tissue culture system salsula industrialized breeding efficiency.

Swainsonasalsula; Primary culture; Explants; Contamination rate

郭刚(1977- )，男，河南南阳人，讲师，硕士，从事药用植物资源开发与抗逆生理研究。*通讯作者，教授，硕士，从事植物病虫害鉴别与防治研究。

2015-02-11

S 188

A

0517-6611(2015)09-028-02