白酒酿造谷物类原料中结合态香气物质的分离及检测分析

朱伟岸， 吴 群， 李记明， 徐 岩*

（1.江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

白酒酿造谷物类原料中结合态香气物质的分离及检测分析

朱伟岸1，2， 吴 群1，2， 李记明2， 徐 岩*1，2

（1.江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

为更好的了解酿造原料的香气物质，作者对以非挥发性前体形式存在的结合态香气物质进行了分析。通过萃取、旋蒸、固相萃取（SPE）得到香气物质前体，水解后结合态香气物质从前体释放，结合顶空固相微萃取（HS-SPME）与气象色谱-质谱（GC-MS）进行香气成分分析。作者对高粱、玉米、大麦、小麦、糯米、大米等6种酿造原料进行了分析，共检测到35种结合态香气物质，其中醇类4种，酯类3种，醛酮类10种，酸类6种，芳香族类4种，萜类6种，杂环类2种。

酿造原料；结合态香气物质；固相萃取（SPE）；顶空固相微萃取（HS-SPME）；气相色谱-质谱（GC-MS）

原料是白酒酿造的基础，它不仅为微生物提供了赖以生长的能量和营养物质，而且自身含有大量香气前体物质，对酿造产品的风味产生重要影响。因此，酿造原料的品质会对酿造产品的质量有很大的贡献。

在国外的葡萄酒研究中，对原料葡萄的研究非常透彻，研究重点主要集中在葡萄自身香气物质上[1]。品种[2]、生长条件[3]、成熟度[4-5]的不同，都会造成葡萄自身香气的差异，并影响到葡萄酒的质量。葡萄酒的香气可分为品种香、发酵香、陈酿香[6]，品种香即葡萄自身香气，分为游离态和结合态两种形式，只有游离态的香气物质才具有香气效果，结合态香气物质以前体形式存在，需要释放变为游离态才是有效的香气物质[2]，果汁经过固相萃取（SPE）分离得到前体，酶解或酸解后释放出香气，进而进行检测分析[2，7]。而结合态香气物质可达游离态香气物质的2～8倍[8]，因此对结合态香气物质进行研究更有意义。

以谷物类为酿酒原料的白酒，原料的研究主要集中在其自身理化性质上：直连和支链淀粉的比例[9]、蛋白质的含量[10]或者单宁[11]、花青素[12]等微量活性物质会影响到微生物的生长，从而影响酒的品质。但是，对原料自身香气物质的研究却很少。谷物类原料是固态基质，不能像葡萄汁那样直接进行固相萃取，从而分离出结合态香气物质的前体，方法的限制使得谷物类酿造原料中结合态香气物质的研究不能顺利进行。作者研究了原料中结合态香气物质（前体）的提取方法，并对水解条件进行了优化，以常见的酿酒原料为研究对象，通过顶空固相微萃取与气象-质谱联用技术，对结合态香气物质进行了定性定量分析。该研究不仅完善了原料香气物质的分析技术体系，而且可以成为评价原料的一种新手段，对酿造产品的品质控制也有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿造原料：江苏某酒厂；无水乙醇、无水甲醇、无水乙醚、戊烷、氯化钠、盐酸、氢氧化钠：分析纯，购自上海国药集团；4-甲基-2-戊醇、乙醇、甲醇及鉴定中标明有RI的化合物：色谱纯，购自Sigma-Aldrich（上海）公司；XAD-2树脂：购自上海安谱科学仪器有限公司。

Agilent GC 6890 N气象色谱和 5975 MSD质谱仪：美国安捷伦公司；MPS-2自动进样器：德国Gerstel公司；FFAP色谱柱 （60 m×0.25 mm×0.25 μm）：上海安谱科学仪器有限公司；真空固相萃取装置（Visiprep DL SPE）：Sigma-Aldrich（上海）公司；循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；BUCHI R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；超声波处理仪：天津Autoscience公司。

1.2 实验方法

1.2.1 前体的萃取参考Cai等[13]关于烟叶中结合态香气物质提取方法并进行改进，分别用甲醇和乙醇进行先后萃取，并配合超声处理。将萃取液在30℃下旋转蒸发至干，加入20 mL超纯水将干物质溶解，即得到前体溶液Ⅰ。

1.2.2 前体的分离纯化将前体溶液Ⅰ用5 mL重蒸乙醚/戊烷萃取（1∶1）萃取，以除去游离态的香气物质。参照果汁中结合态香气物质的分离方法，采用固相萃取（SPE）的方法[2]将得到的前体溶液进一步分离纯化，得到更加纯净的前体溶液Ⅱ。

1.2.3 前体水解条件的优化

1）水解pH的优化：前体会在酸性条件下释放出香气物质，以高粱样品作为样本，用1 mol/L的盐酸和1 mol/L的氢氧化钠溶液调节前体溶液的pH，得到pH为6、5、4、3、2、1的样品溶液。将调好pH的样品密封后，沸水浴处理30 min。

2）水解时间的优化：按照上述优化后的结果调节前体溶液pH密封后，沸水浴分别处理10、20、30、40、50、60 min。

1.2.4 HS-SPME-GC-MS定性定量分析

1）HS-SPME及GC-MS分析条件：参考Xu等[14]利用HS-SPME-GC-MS测定香气物质的方法，取8 mL水解后的样品加入到顶空瓶中，用氯化钠饱和，加入10 μL内标 （4-甲基-2-戊醇，43.60 mg/L），进行顶空固相微萃取。萃取条件为：60℃平衡5 min，吸附萃取45 min；GC-MS解吸附5 min，250℃。

GC条件：进样口温度250℃，载气 He，流速 2 mL/min，不分流进样。升温程序：50℃保持2 min，以6℃/min速率升温至230℃，并保持15 min。MS条件：EI电离源，离子源温度 230℃，电子能量 70 eV，扫描范围35～350 amu。

2）定性及定量分析：首先通过质谱谱库检索与NIST 05 a.L库的标准质谱图比对定性，然后再通过计算所测物质的保留指数（RI），并与文献中报道的RI值进行比对定性。以超纯水为溶剂配置一定浓度的待测物标准液，并进行梯度稀释。每个梯度的标准液取8 mL于顶空瓶中进行分析，分析条件与样品分析条件相同。采用选择离子（SIM）计算各化合物的峰面积，以化合物和内标物质的峰面积比为横坐标，质量浓度比为纵坐标，建立标准曲线。样品经GC-MS检测后，将待测物质与内标物质的峰面积比代入标准曲线方程，计算出样品中该物质的质量分数，再换算为原料中的质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 水解条件的优化

结合态香气物质的前体需要经过酶解或者酸解才可以变为挥发性的香气物质释放出来，酸解与酶解相比所得香气物质的种类和产量更多。为更好地了解酿造原料中结合态香气成分，作者选择了对前体进行酸解处理的方案。但是水解时的pH以及水解时间都会对释放的香气含量有影响，因此在进行香气物质分析之前，对水解条件进行优化，优化的指标为水解后检测到的香气物质总峰面积（最大组按100%计）和种类数。

首先，对水解时的pH进行了探究，结果见图1。结果表明：当pH＞3时，水解后检测到的香气物质总峰面积基本上是pH≤3时的一半，香气物质种类也要少；在pH 1、2、3水解后检测到的香气物质总量相差不大，香气物质的种类均为27种。因此本实验中选取了pH 3作为优化后的条件。

水解时间对释放香气物质的影响结果见图2。水解30 min时，释放香气物质的总量已达到平衡，而且此时得到香气物质的种类也达到最多，为27种，因此选择水解30 min为最优水解时间。综合结果可得，最佳的前体物质水解条件为：pH 3、30 min。

图1 pH值对释放香气物质的影响Fig.1 Effect of pH on the release of aroma compounds

图2 水解时间对释放香气物质的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on the release of aroma compounds

2.2 酿造原料中结合态香气物质的分析

经过有机溶剂萃取、旋蒸、水溶、固相萃取（SPE）等步骤，分别提取了高粱、玉米、大麦、小麦、大米、糯米等6种酿造原辅料中结合态香气物质的前体。水解后，应用HS-SPME结合GC-MS技术对结合态香气物质进行分析，共定性定量了35种香气化合物，见表1。这些物质基本上均在在白酒中有检测到[15-16]，包括α-萜品醇、β-大马酮等微量成分。

酯类化合物：白酒中含量最为丰富的一类化合物，在原料中共检测到了己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、棕榈酸乙酯等3种酯类结合态酯类物质，但是含量不是很多。

醇类化合物：醇类物质是酒中重要的呈香物质，原料结合态香气物质中共检测到4种醇类物质，分别是3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛烯-3-醇和1-辛醇。其中 1-己醇的质量分数在288.69～399.42 μg/kg，是质量分数较多的一种醇类物质；1-辛烯-3-醇具有淡淡的蘑菇香气[17]，是比较特殊的一种醇类，质量分数在52.01～132.18 μg/kg。

酸类化合物：酸类物质都是和醇类反应生成酯的前驱物，共检测到戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、E-2-辛烯酸6种酸类物质。壬酸的平均质量分数最高，为123.58 μg/kg。其次是己酸和辛酸，E-2-辛烯酸在汾酒中虽有过报道[15]，但是却没有进行定量分析，几种原料中的质量分数为14.83～123.95 μg/kg。

醛酮类化合物：醛酮类物质是结合态香气物质中种类及含量最多的一类化合物，平均占到所有结合态香气物质含量的38%左右。在检测到的10种醛酮类化合物中癸醛的质量分数最多，在185.22～259.76 μg/kg之间；1-辛烯-3-酮具有淡淡的蘑菇清香[18]，平均质量分数为35.47 μg/kg；反，反-2，4-壬二烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛两种二烯醛具有淡淡的脂肪香[19]，平均质量分数分别为111.65、58.41 μg/kg。

芳香族类化合物：芳香族类化合物可以使酒的口感更加和谐，共检测到苯乙醛、苯甲醇、β-苯乙醇、苯酚等4种芳香族类物质。其中β-苯乙醇具有玫瑰韵味[20]，而苯酚的质量分数最高，达210.82 μg/kg。

杂环类化合物：共检测到2种杂环类结合态香气物质，2-戊基呋喃和四甲基吡嗪，仅在高粱、豌豆、玉米中检测到了四甲基吡嗪。

萜类化合物：萜类物质葡萄酒中重要的一类香气物质，大部分以前体形式存在，在发酵及陈酿过程中逐渐释放出来，近几年来在白酒中也发现这类重要的化合物[21]。谷物类原料可以为酒提供里哪醇氧化物、α-柏木烯、α-萜品醇、β-大马酮、香叶基丙酮、脱氢-β-紫罗兰酮等6种萜烯类物质；香叶基丙酮的质量分数最多，平均为24.81 μg/kg，与清香型白酒相似。

将各原料中结合态香气物质质量浓度进行Z标准化后制作热图，见图3。可以看出，每种原料中结合态香气物质质量浓度差别比较大。比如大麦中3-甲基-1-丁醇（序号4）的质量浓度非常高，而该物质是一种让人“上头”的高级醇，俗话说的“大麦冲”可能也有这方面的原因；而玉米中萜烯类物质（序号30-35）总体上均高于其他几种原料，而这些萜烯类物质都具有甜甜的果香、花香，这就促成了“玉米甜”。

表1 酿造原料中结合态香气物质的质量浓度Table 1 Bound aroma compounds in raw brewing materials

续表1

总之，这些结合态香气物质在经过微生物酶促作用或者蒸馏作用，从前体释放，构成了酿造产品的重要风味物质，这都证明了研究酿造原料中结合态香气物质的重要性。

3 结语

图3 6种酿造原料中结合态香气物质质量浓度热图Fig.3 Heat map of bound aroma compounds in 6 raw brewing materials

酿造原料中含有一些以前体形式存在的结合态香气物质，这些香气物质会在发酵过程或者蒸馏过程中释放出来，成为酿造产品风味的组成部分，不同原料中结合态香气物质的种类和质量浓度均有差别。作者建立了一种酿造原料中结合态香气物质的提取方法，并结合顶空固相微萃取与气象质谱联用技术对其进行了定性定量分析，方法简单、实用。利用该方法对酿造原料中的结合态香气物质进行分析，可以成为筛选原料的一种新的手段，为今后深入的研究原料与酒之间的品质关系和质量控制提供了技术支持。

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Isolation and Analysis of Bound Aroma Compounds in Different Raw Brewing Materials

ZHU Weian1，2， WU Qun1，2， LI Jiming2， XU Yan*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Raw cereal materials are the basis for Chinese liquor making，which determine the quality of liquor.In order to have a better understanding of aroma compounds in raw brewing materials，the bound aroma compounds which exist in the style of precursors were analyzed in this study.The precursors could be got from several processes：extraction with organic solvent，dryness with rotary evaporator in vacuo，and SPE.The free compounds were released from precursors after acid hydrolysis.Then these bound aroma compounds were investigated by HS-SPME-GC-MS.In this study，bound aroma compounds in 6 cereals were analyzed and the total of 35 bound aroma compounds were identified and quantified，including 4 kinds of alcohols，3 kinds of esters，10 kinds of ketones and aldehydes，6 kinds of acids，4 kinds of aromatic compounds，6 kinds of terpenoids，and 2 kinds of heterocycle compounds.

brewing materials，bound aroma compounds，SPE，HS-SPME，GC-MS

TS 261

A

1673—1689（2015）05—0456—07

2014-02-08

国家863计划项目（2012AA021301，2013AA102108）；国家自然科学基金项目（31000806，31371822，31271921）；2011协同创新计划。

*通信作者：徐 岩（1962—），男，浙江慈溪人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事酶工程与发酵工程方面的研究。

E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn