苋菜活性物提取工艺及抑菌活性研究

夏日照 谢 燕 尹 维 张 亚 廖晓兰

（湖南农业大学植物保护学院，植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南长沙 410128）

苋菜活性物提取工艺及抑菌活性研究

夏日照 谢 燕 尹 维 张 亚 廖晓兰*

（湖南农业大学植物保护学院，植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南长沙 410128）

以对柑橘溃疡病菌抑制率为考察指标，采用乙酸乙酯浸提苋菜叶干粉，获得苋菜活性物，通过正交试验分别考察料液比、提取次数、提取时间对苋菜活性物提取效果的影响。结果表明：不同因素对苋菜活性物提取效果的影响程度不同，依次为料液比＞提取温度＞提取时间；正交试验优化得到苋菜活性物最佳提取工艺参数为：料液比1∶5、提取温度30 ℃、提取时间24 h，在此条件下苋菜活性物的抑制率为73.81%。紫外线、C源（蔗糖）和无机盐离子（NaCl）的胁迫作用均对苋菜活性物抑菌活性影响不大；苋菜活性物有一定的耐热性，温度为80 ℃时抑制率仍可达49.41%。

苋菜活性物；正交试验；提取工艺；抑菌活性

苋为苋科苋属（Amaranthus L.）作物总称，生长快、耐瘠、耐旱，种植地区分布全球，我国大部分地区都有栽培，按其栽培目的不同可分为粒用苋、菜用苋、饲用苋、观赏苋等，Teutonico与 Knorr等学者把苋鉴定为主要是菜用型，认为所有苋属物种的叶子均能食用，因此习惯上把苋统称为苋菜（肖深根 等，2000）。目前苋菜（Amaranthus tricolor）的开发利用涉及食用（Silva-Sanchez et al.，2008）、工业（王宁 等，2009）、观赏（汪劲武，1996）、饲用（武之新和徐玉鹏，1997）以及医用（Mendonca et al.，2009；Zeashan et al.，2009） 等方面，有关苋菜在农业植物病害防治方面的研究鲜见报道，仅有Lyapkova等（2001）研究发现苋菜种子含有抗真菌多肽，可抑制部分植物病原真菌；Abd Aziz等（2011）研究发现苋菜叶片中提取的蛋白质对黄瓜花叶病毒（CMV）具有显著的抑制作用。笔者在研究过程中发现苋菜活性物对柑橘溃疡病菌（X. axonopodis pv. citri）、水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）、西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）、烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）以及欧式杆菌（Erwinia carotovora）等常见植物病原细菌有极好的室内平板抑制效果，其中对柑橘溃疡病菌的离体试验结果表明苋菜活性物在防治植物细菌性病害方面有巨大的潜力（尹维，2014）。

本研究在前期试验的基础上，为获得大量稳定的苋菜活性物，采用正交试验对苋菜活性物提取工艺进行优化和完善，并对其稳定性进行了初步探究，以期为苋菜活性物进一步开发为新型生防制剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2014年7～9月在植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室进行。供试苋菜由湖南农业大学浏阳科研基地提供，选取株高为18～23 cm的圆叶红苋菜，取叶片洗净、晒干，高速粉碎机粉碎，过60目筛，阴凉处保存备用。试验指示菌为柑橘溃疡病菌，由湖南农业大学植物病理学实验室提供，铂尚生物技术（上海）有限公司测序比对（表1）。

表1 柑橘溃疡病菌测序结果

供试培养基为蔗糖蛋白胨培养基：蔗糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、磷酸氢二钾0.5 g、结晶硫酸镁0.25 g、琼脂24.0 g、蒸馏水1 000 mL、pH值7.0～7.2。

1.2 菌悬液制备及抑菌活性测定

柑橘溃疡病菌菌悬液制备：挑取活化培养24 h的标准菌落，加入无菌水，比对麦式比浊管，调整菌悬液浓度为3×108cfu·mL-1。

抑菌活性测定：采用抑菌圈法（孙长霞 等，2012），在蔗糖蛋白胨培养基表面接种200 μL菌悬液并涂布均匀，取已灭菌的打孔器（Φ=7 mm）在培养皿中心打取小孔，分别注入苋菜活性物150 μL，设相应空白对照，重复2次；26～28 ℃培养24 h，观察抑菌圈的大小，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.3 苋菜活性物制备

称取40.0 g苋菜叶干粉，按料液比1∶20加入乙酸乙酯（分析纯，下同），常温振荡提取24 h，收集上清液；40 ℃旋蒸至膏状物，80 mL无水乙醇（分析纯，下同）溶解定容，冷藏备用。

1.4 苋菜活性物提取纯化工艺优化

在单因素试验基础上，选取提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）3个因素对苋菜活性物提取工艺进一步优化，采用L9（34）正交表进行试验（表2），以确定最佳提取条件。

称取苋菜叶干粉20.0 g，放入1 000 mL锥形瓶中，按设计的料液比（加入乙酸乙酯）、温度和时间进行提取。

将上述处理液在摇床上常温振荡提取24 h，重复1次，收集上清液；40 ℃减压旋蒸至膏状物，40 mL无水乙醇溶解定容，抑菌活性测定方法同1.2。

1.5 苋菜活性物的稳定性

1.5.1 温度处理 取冷藏的苋菜活性物6份，分别在50、60、70、80、90、100 ℃条件下水浴处理20 min，以未处理苋菜活性物为对照，抑菌活性测定方法同1.2。

1.5.2 紫外线照射处理 取冷藏的苋菜活性物6份，分别用紫外灯照射处理5、15、30、60、120 min，以未处理苋菜活性物为对照，抑菌活性测定方法同1.2。

1.5.3 C源和无机盐离子胁迫作用 取冷藏的苋菜活性物10份，分别按体积比2∶1与浓度为10%、20%、30%、40%、50%的蔗糖溶液和浓度为5%、10%、15%、20%、25%的NaCl溶液混合，配制成含不同浓度糖和NaCl的混合液，以未处理苋菜活性物为对照，抑菌活性测定方法同1.2。

1.6 数据处理

活性物浓度（g·mL-1）=膏状物质量/定容有机溶剂

采用DPS、Excel软件进行数据处理，运用Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 苋菜活性物提取工艺优化

由表2极差分析可知，RB＞RA＞RC，即各因素对苋菜活性物提取效果的影响程度依次为料液比＞提取温度＞提取时间。在本试验设计范围内，苋菜活性物的最佳提取条件为B1A1C3，即当料液比为1∶5、提取温度为30 ℃、提取时间为24 h时苋菜活性物抑菌效果最佳。按B1A1C3条件进行3次平行试验，抑菌圈直径达到46.53 mm，抑制率为73.81%，高于表3中任意一组试验结果，故B1A1C3为苋菜活性物最优提取条件。

表2 苋菜活性物提取工艺优化的L9（34）正交试验结果

2.2 温度对苋菜活性物抑菌活性的影响

如图1所示，当温度为50～80 ℃时，苋菜活性物抑菌活性基本没有变化，抑制率维持在50%左右；当温度超过80 ℃时，抑菌活性明显开始下降；当温度达到100 ℃时，基本丧失了抑菌活性，抑制率仅为19.12%。这表明苋菜活性物在一定温度范围内具有较好的热稳定性，但过高的温度会破坏活性物结构，从而使其失活，降低抑菌活性。

图1 不同温度对苋菜活性物抑菌活性的影响

2.3 紫外线对苋菜活性物抑菌活性的影响

如图2所示，紫外灯照射处理时间对苋菜活性物抑菌活性影响不大，抑制率基本维持在55%左右。由此可见，苋菜活性物分子结构稳定，活性基团不易被破坏，对紫外光具有极高的稳定性。

图2 不同紫外线照射时间对苋菜活性物抑菌活性的影响

2.4 C源和无机盐离子对苋菜活性物抑菌活性的影响

如图3、4所示，随着蔗糖和NaCl浓度的增加，苋菜活性物的抑制率变化不明显，维持在48%左右。表明苋菜活性物本身具有较好的抑菌作用，无机盐离子（NaCl）、C源（蔗糖）对苋菜活性物的胁迫作用不明显。

图3 不同蔗糖浓度对苋菜活性物抑菌活性的影响

图4 不同NaCl浓度对苋菜活性物抑菌活性的影响

3 结论与讨论

L9（34）正交试验结果表明，苋菜活性物最佳提取工艺为料液比1∶5、提取温度30 ℃、提取时间24 h，对柑橘溃疡病菌的抑制率为73.81%。但是在试验过程中发现，随着提取苋菜干粉质量的增加，该工艺组合往往不能达到预期的提取效果。这可能是因为1∶5的料液比太小，无法充分溶解苋菜干粉和振荡，在造成试验材料消耗的同时，影响了结果的精确性、稳定性，不利于苋菜活性物的大量提取。当料液比1∶20、温度30 ℃、提取时间24 h（B3A1C3）时，与理论最优条件B1A1C3的抑制率差别不大（B3A1C3为71.13%，B1A1C3为73.81%），而且二者所用乙酸乙酯的回收率也都达到了90%以上。这解决了试验过程中因溶剂较少而降低提取效率的问题，同时也迈出了苋菜活性物由试验提取走向生产应用的关键一步，为苋菜活性物的工业化大规模提取，实现活性成分的分离合成提供了技术可能。

植物源活性成分种类繁多，稳定性不一，其活性会因光照、紫外线、温度以及金属盐离子等因素而受到破坏（吴传万 等，2004）。苋菜是一种功能性蔬菜，富含红色素、花色苷色素、酚类、蛋白质、黄酮类、角烯鲨等活性成分。红色素主要以溶剂浸提和超声波萃取为主（吕玉珍 等，2010；陈晓光 等，2012；曾庆祝 等，2012；张瑞 等，2013）；植物甾醇和三萜类皂苷合成先导物角鲨烯的提取方法也有研究（岳才军 等，2010）；至于黄酮类、蛋白质等常见植物源活性成分更是有完整的提取工艺（李启照，2013；林燕茹和张晓芝，2013）。本试验提取的苋菜活性物稳定性好，在紫外线、C源和无机盐离子的胁迫下抑菌活性基本保持不变；耐热性好，80 ℃时对柑橘溃疡病菌的抑制率仍有49.41%。这说明苋菜中可能含有与目前已发现提取的活性物不同的活性成分，且性质稳定，能满足田间复杂环境的要求，有利于推动苋菜活性物从实验室向大田应用的转变。因此，纯化和了解其活性成分，不仅对了解苋菜活性物的抑菌机制有重要意义，而且对苋菜活性物的开发利用等都有重要的理论参考和实用价值。

苋科植物种类繁多，总计60属约850种，多以草本或灌木为主，其中苋属是苋科植物重要的一科，该属有反枝苋（Amaranthus retroflexus）、籽粒苋（Amaranthus hypochondriacus L.）、刺苋（Amaranthus spinosus）、 尾 穗 苋（Amaranthus caudatus L. ）、绿穗苋（Amaranthus hybridus L. ）等40余种。随着科技进步，苋科植物在农用和药用方面的价值逐渐受到人们关注。Lina和Manuel（2007）从籽粒苋中分离出一种抗真菌肽，对白色念珠菌（Candida albicans）、褐黄曲霉（Aspergillus ochraceus）等真菌表现出极佳的抑制作用；绿穗苋和尾穗苋对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等细菌也表现出显著的抑菌活性（Maiyo et al.，2010）；作为重要外来入侵生物的反枝苋也在植物化感作用和改善植物根际土壤方面表现出促进作用（Zhang & Mu，2008；龚振平 等，2010）。上述报道均表明了苋菜中是含有抑菌活性物的，且可以利用一定提取方法进行有效提取。这与本试验结果是一致的，为进一步挖掘苋菜及其他苋科植物作为植物源农药新材料和探究苋菜活性物具体结构提供了科学依据。

参考文献

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“什么是今天该有的男性气质”,《人民日报》评论员如是发问。是传统意义上的“金戈铁马”的豪情壮志,亦或是大行其道的“桃面柔膝”？而依我之见，正气凛然，刚健勇毅的精神风貌，方才是今日中国男儿所应该追求的。

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Extraction and Antibacterial Activity of Actives Sub

XIA Ri-zhao，XIE Yan，YIN Wei，ZHANG Ya，LIAO Xiao-lan*
（Hunan Key Lab. Biol & Ctrl of Plant Dis & Pests，College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Took inhibition ratio of citrus cankor pathogen as investigation target，lixivite dry powder of Amaranthus leaf blades with ethyl acetate and gained Amaranthus tricolor actives．Examined the effect of solidliquid ratio，extraction temperature，and extraction time of Amaranthus tricolor actives by orthogonal experiment．The results indicated that different factors had different degree effects on extraction efficiency．Three extraction parameters were ranked in descending order of their effect on extraction of Amaranthus tricolor actives as follows solid-liquid ratio＞extraction temperature＞extraction time．Their optimal levels were 1∶5，30 ℃，24 h，respectively．Under these conditions，the inhibition rate was 73.81%．Ultraviolet radiation，C source（sucrose）and inorganic ion（NaCl） stress had little effects on Amaranthus tricolor actives stability．It posses certain heat tolerance，its inhibition rate was still up to 49.41%，when the temperature was 80 ℃．

Amaranthus tricolor active；Extraction technology；Antibacterial activity

夏日照，男，硕士研究生，专业方向：植物病害生物防治，E-mail：908302479@qq.com

*通讯作者（Corresponding author）：廖晓兰，女，教授，博士生导师，专业方向：生防资源的挖掘与利用，E-mail：liaoxl88@126.com

2015-01-07；接受日期：2015-04-05