蔬菜土传病害生防木霉菌株资源的筛选及其防治效果评价

（农业部蔬菜遗传改良重点开放实验室，中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

蔬菜土传病害生防木霉菌株资源的筛选及其防治效果评价

朱萍萍 凌 健 席亚东 陈国华 茆振川 杨宇红*谢丙炎

（农业部蔬菜遗传改良重点开放实验室，中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

采用平板对峙接种法和温室盆栽试验，测定18种木霉共175个菌株对黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉病菌和番茄青枯病菌3种不同类型的蔬菜土传病害病原菌的防效，筛选生防木霉资源。试验结果表明：拮抗试验中，拮抗黄瓜枯萎病菌的木霉菌株有50株，抑制率达70.0%～86.3%；拮抗辣椒疫霉病菌的木霉菌株43株，抑制率达70.4%～88.7%。盆栽试验中，筛选出番茄青枯病的生防菌株32株，防效达50.0%～92.7%。进一步对在拮抗试验中对黄瓜枯萎病菌抑制率达75%以上的其中13株木霉菌进行盆栽防效评价，获得防效超过60%的高效菌株2株，分别为T52（深绿木霉）和32080（平菇木霉）。

木霉；黄瓜枯萎病菌；辣椒疫霉病菌；番茄青枯病菌；生物防治

木霉作为一类重要的生防菌，其生境广、环境适应能力强，在几乎所有温度的自然土壤中均有存在，在朽木、树皮及其他真菌中（Kubicek et al．，2008）、甚至在昆虫体内（Yoder et al．，2008）、海洋中（Gal-Hemed et al．，2011）均能分离到木霉菌株。木霉生长繁殖速度快，种群资源丰富，对植物有良好的促生或生防作用，是目前研究、应用最多的生防菌之一。

特定种类的木霉不仅能显著促进植物的生长发 育（Chang et al．，1986；Yedidia et al．，2001；Vinale et al．，2008），还能直接拮抗植物病原微生物，或通过诱导植物产生系统抗性及局部抗性等发挥生防作用（Hermosa et al．，2012），如朱廷恒等（2004）研究发现木霉菌株T97可通过竞争和重寄生对多种植物病原真菌产生较强的拮抗作用；Shoresh等（2005）的研究结果显示棘孢木霉菌株T203参与诱导黄瓜产生系统抗性的茉莉酸或水杨酸途径；Moran-Diez等（2009）研究表明哈茨木霉菌株T34能通过分泌多聚半乳糖醛酸内切酶诱导拟南芥（Arabidopsis）产生类似系统抗性的反应；Mastouri等（2012）报道哈茨木霉菌株T22处理番茄种子，可通过诱导叶绿体内超氧化物歧化酶基因表达，整株植物体内该酶活性显著提升，增强幼苗活力，减轻冷、热及盐等胁迫对植株的影响，从而促进番茄生长。因此，采用木霉生防植物病原菌，不仅可以显著减少化学农药的使用，而且能通过促进植物生长等增强植物应对生物、非生物因素胁迫的能力（Moran-Diez et al．，2009；Hermosa et al．，2012），进而解决化学肥料、农药等带来的一系列生态环境问题。虽然木霉资源丰富，但已知高效、稳定的生防菌株资源仍然十分匮乏。为寻找能有效控制蔬菜主要土传病害的木霉资源，本文以前期工作获得的175株木霉菌株为原始材料，采用平板对峙及温室盆栽防治的方法筛选对黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉病菌及番茄青枯病菌3种土传病害病原菌具有拮抗或防治活性的木霉菌株，旨在为蔬菜土传病害的生物防治提供新的菌株资源和科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试木霉菌株共175株，包括18个种，主要为哈茨木霉（表1），由湖南农业大学、湖南农业科学院、河北科技师范学院、山东农业科学院、中国农业微生物菌种保藏中心、中国农业科学院植物保护研究所和中国农业科学院蔬菜花卉研究所7个单位提供。

供试致病菌株分别为Fuw-BN-7（黄瓜枯萎病菌，Fusarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen）、Phy-01（辣椒疫霉病菌，Phytophthora capsici）、RS-60（番茄青枯病菌，Ralstonia solanacearum），由本所病害课题组分离纯化保存。

表1 供试木霉菌及其拉丁名

1.2 供试作物

供试黄瓜品种为中农6号，番茄品种为丽春，均购自中蔬种业科技（北京）有限公司。

1.3 拮抗效果测定

2014年4月，参考肖淑芹等（2011）的平板对峙接种方法，测定175株木霉对黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉病菌的拮抗效果。每处理3次重复，每重复3个平板。28 ℃恒温黑暗培养5 d后，分别测量木霉处理及对照种内病原菌的菌落直径，记录菌落生长状况，计算抑制率。

抑制率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/（对照病原菌菌落直径）×100%

1.4 温室盆栽防效测定

1.4.1 木霉菌对番茄青枯病盆栽防效测定 将在PDA平板上28 ℃恒温黑暗培养7 d的木霉菌用搅拌机搅碎，每皿加水400 mL，制成木霉菌液，于2014年4月番茄幼苗3～4叶期浇灌于植株根部，每株灌菌液30 mL；待木霉菌在土中定殖7 d后采用伤根灌注法接种番茄青枯病菌，接种浓度为1×107cfu·mL-1，接种时用刀片划伤根部后每株用20 mL菌液灌根。以浇灌清水和硫酸链霉素800倍液分别作阴性对照（CK-）和阳性对照（CK+）。

1.4.2 木霉菌对黄瓜枯萎病盆栽防效测定 选择对黄瓜枯萎病菌平板拮抗效果达75%以上的其中13株木霉菌，进一步测定其温室盆栽防治黄瓜枯萎病的效果。具体方法：2014年5月将在PDA平板上28 ℃恒温黑暗培养7 d的木霉菌用搅拌机搅碎，每皿加水400 mL，制成木霉菌液，每盆育苗土接种2皿木霉菌搅碎后的菌液并混合均匀，置室温下保湿培养7 d后，将黄瓜枯萎病菌采用胚根接种法接种（翁祖信 等，1985），接种后直接播于该育苗土上，以未经木霉处理的育苗土作空白对照。

盆栽试验每处理3次重复，每重复10株幼苗。待空白对照严重发病时，调查各处理病株率或病级数（中华人民共和国农业部，2010），并计算病情指数和防治效果。

病情指数=∑（各级病株数×相对应级别数）/（调查总株数×最高级值）×100

防治效果（%）=〔对照病情指数（或病株率）-处理病情指数（或病株率）〕/对照病情指数（或病株率）× 100%

2 结果与分析

2.1 木霉对黄瓜枯萎病菌的拮抗效果

供试的175株木霉菌对黄瓜枯萎病菌均有一定的拮抗作用，拮抗效果为39.1%～86.3%。其中，抑菌率达50%以上的木霉菌株有170株；抑菌率超过70%的木霉菌株50株（表2），包含13个种，主要为哈茨木霉、长枝木霉及T. asperelloides；抑菌率达80%的木霉菌株4株，分别为长枝木霉2株（T29、T60），绿木霉1株（T47），深绿木霉1株（T52）。木霉菌在PDA平板上对黄瓜枯萎病菌的拮抗效果主要表现为竞争作用和重寄生作用（图1），以竞争作用为主，占供测菌株的87.1%，包括所有参试木霉种。

表2 部分木霉菌对黄瓜枯萎病菌的拮抗效果

图1 部分木霉菌对黄瓜枯萎病菌（平板上方）的拮抗效果

2.2 木霉对辣椒疫霉病菌的拮抗效果

参试木霉菌株对辣椒疫霉病菌的抑菌率为36.0%～88.7%，均表现一定的拮抗作用，且91.8%的参试木霉菌株的抑菌率在50%～80%。其中，抑菌率在70%以上的菌株有43株 （表3），包含7个种，主要为哈茨木霉、长枝木霉及T. asperelloides；抑菌率超过80%的菌株10株，分别为哈茨木霉4株（T152、T175、Shi-8-9、mc-2），长枝木霉2株（T29、T127），T. asperelloides 2株（T33、30437），柠檬绿木霉1株（T169），平菇木霉1株（32080）。木霉菌株拮抗辣椒疫霉病菌的机制主要为竞争和重寄生（图2），其中具有竞争作用的菌株94株，包括所有的参试木霉种。

2.3 木霉对黄瓜枯萎病的盆栽防效

对平板拮抗试验中对黄瓜枯萎病菌抑菌效果达75%以上的其中13株木霉菌株进行盆栽防效测定，发现供测木霉对黄瓜种子的出苗率、植株生长均无不利影响，但总体防效不高，绝大部分木霉菌株的盆栽防效在40%以下，远低于离体拮抗效果（图3），仅筛选出防效超过60%的木霉菌株2株，即T52（深绿木霉）和32080（平菇木霉），防效分别为72.0%和60.1%。

表3 部分木霉菌对辣椒疫霉病菌的拮抗效果

图2 部分木霉菌对辣椒疫霉病菌（平板下方）的拮抗效果

2.4 木霉对番茄青枯病的盆栽防效

木霉盆栽防治番茄青枯病的测定结果表明，绝大多数木霉菌株对番茄青枯病盆栽防治效果不佳，一些木霉菌甚至加重青枯病的发生。在参试的175株木霉菌株中，防治青枯病效果达50%以上的木霉菌株有32株（表4），包含11个种，哈茨木霉菌株占46.9%；其中，防效接近或超过对照药剂硫酸链霉素（69.2%）的木霉菌株20株，分别属于9个种；防治效果达到80%以上的菌株4株，分别为T87（微孢木霉）、T173（哈茨木霉）、Shi-1-10（T. asperelloides）和18-8（棘孢木霉）。

图3 木霉菌对黄瓜枯萎病菌的平板拮抗作用和盆栽防治效果

表4 部分木霉菌对番茄青枯病的盆栽防效

3 结论与讨论

本试验中供试175株木霉菌株包含18个种，种质资源丰富，且来源于全国多个省份农作物种植区的土壤、腐朽的木头及死亡线虫虫体等，已有研究表明部分菌株具有促进植物生长、生防蔬菜病原线虫的潜力（未发表数据）。相对于目前主要的生防木霉种哈茨木霉、长枝木霉、钩状木霉和绿色木霉等，本试验扩大了木霉种类的筛选范围，发现一些研究甚少的木霉种类对蔬菜土传病害具有较好的生防潜力。如T. asperelloides是近几年才与棘孢木霉在种水平上区分开的一种新的木霉种，目前对其生防潜力的研究甚少。本试验通过对11株T. asperelloides生防3种主要蔬菜土传病害病原菌的初步研究，筛选出针对不同病害有生防效果的菌株，为进一步深入研究该种和挖掘新的生防木霉资源提供了科学依据。

哈茨木霉、长枝木霉及T. asperelloides为平板对峙试验中筛选出生防菌株最多的3个种，且对黄瓜枯萎病菌的最高平板抑制率均超过75%，而对辣椒疫霉病菌则高达80%以上，为极具生防潜力的木霉种类，因此，在木霉生防菌株筛选时需要引起重视。

木霉菌株生防黄瓜枯萎病的平板对峙和温室盆栽试验结果表明，木霉菌株对该病菌的拮抗作用并不与盆栽防效成正相关。这可能是因为木霉生长速度快，因而在平板上生长时具有明显的竞争优势，而在盆栽试验中，木霉的生长优势不一定能体现出来；除了共有的竞争、抗生和重寄生等生防机制（Atanasova et al．，2013；刘增亮 等，2014；Abo-Elyousr et al．，2014）外，在温室盆栽时，木霉不仅需要与病原菌竞争有限的空间和资源，还要与植物互作，通过与病原菌竞争植物表面的生态位、诱导植物产生抗性等多种机制生防病原菌（Bae et al.，2009）。木霉菌的生防机制研究仍是以后的工作重点之一。

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Screening and Bio-control Effect Assessment of Trichoderma Strains against 3 Soilborn Vegetable Pathogens

ZHU Ping-ping，LING Jian，XI Ya-dong，CHEN Guo-hua，MAO Zhen-chuan，YANG Yu-hong*，XIE Bing-yan
（Vegetable Genetic Improvement，Ministry of Agriculture Key Laboratory，Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081，China）

This paper had screened the bio-control resources of 18 Trichoderma species，including 175 strains，against 3 kinds of soil-born vegetable pathogens as Fusarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen，Phytophthora capsici and Ralstonia solanacearum through confront culture experiments and green house potted plant experiments. The results indicated that through confront culture experiments，we have screened out 50 Trichoderma strains with inhibitation rate as 70.0%-86.3% against Fusarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen，and 43 Trichoderma strains with inhibitation rate as 70.4%-88.7% against Phytophthora capsici．And the potted plant experiments have screened out 32 Trichoderma strains with bio-control efficacy of 50.0%-92.7% against Ralstonia solanacearum．We further assessed the bio-control efficacy of 13 Trichoderma strains with antagonistic inhibitation rate higher than75% by potted plant experiment，and found 2 Trichoderma strains T52 （Trichoderma atroviride） and 32080 （Trichoderma pleurotum） with high bio-control efficacy over 60%．

Trichoderma spp.；Fusarium oxysporum f. sp. cucumebrium Owen；Phytophthora capsici；Ralstonia solanacearum；Bio-control

朱萍萍，女，硕士研究生，专业方向：分子植物病理学，E-mail：ping574992751@126.com

*通讯作者（Corresponding author）：杨宇红，研究员，专业方向：植物病理学，E-mail：yangyuhong@caas.cn

2015-03-09；接受日期：2015-04-21

国家公益性行业（农业）科研专项（201303014），国家大宗蔬菜产业技术体系建设项目（CARS-25-B-01），农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目