单纯疱疹病毒2 gD基因的树突细胞疫苗免疫效应研究

樊建勇 王颖 杨慧兰 梁洁 李翠华

单纯疱疹病毒2 gD基因的树突细胞疫苗免疫效应研究

樊建勇 王颖 杨慧兰 梁洁 李翠华

目的观察单纯疱疹病毒2 gD(HSV-2 gD)基因的树突细胞(DC)疫苗在动物实验中诱发特异性免疫应答情况。方法用腺病毒介导的、HSV-2 gD基因修饰的DC(pAdeno-HSV-2 gD-DC)疫苗免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第10天检测小鼠血清中gD IgG水平;同时,分离小鼠脾淋巴细胞,用HSV-2gD蛋白刺激,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况、乳酸脱氢酶释放法测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性及ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中干扰素γ(IFN-γ)、白介素4(IL-4)水平。实验分为4组,pAdeno-DC组、pAdeno-HSV-2 gD-DC组、DC组、空白对照组,每组10只。结果pAdeno-HSV-2 gD-DC组小鼠血清内可检测到高滴度针对HSV-2gD蛋白的抗体(A450值为0.313±0.034),与pAdeno-DC组(0.034±0.009)、DC组(0.028±0.009)、空白对照组(0.026±0.010)比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。pAdeno-HSV-2 gD-DC可以诱导小鼠脾淋巴细胞增殖(刺激指数为1.600±0.215)、有效杀伤靶细胞(CTL活性为37.1%),与pAdeno-DC组(分别为1.063±0.070和16.0%)、DC组(1.056±0.063和14.9%)、空白对照组(1.020±0.051和15.7%)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)。pAdeno-HSV-2 gD-DC组小鼠分离的脾细胞培养上清可以检测到高水平IFN-γ(A450值为0.568±0.031) 和IL-4(A450值为0.544±0.043),与pAdeno-DC组(0.266±0.021和0.278±0.037)、DC组(0.271±0.023和0.275±0.044)、空白对照组(0.252±0.012和0.245±0.051)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论构建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗可以在小鼠中产生较强的特异性免疫应答。

疱疹病毒2型,人;树突细胞;单纯疱疹病毒疫苗

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)包括HSV-1和HSV-2两型,HSV-2一般与外生殖器感染有关。在防治HSV-2感染的方法中,疫苗是免疫治疗的重要手段。树突细胞(dendritic cell,DC)疫苗由于能诱导出较好的细胞免疫和体液免疫而日益受到重视。合适的靶点是制备有效疫苗的关键,在HSV-2编码的糖蛋白中,gD是产生中和抗体的主要糖蛋白,也是宿主细胞免疫和体液免疫反应的重要靶标［1］。前期工作中,我们利用安全、高效、简便的腺病毒作为载体,将HSV-2-gD基因转染DC,构建了含HSV-2 gD基因的DC(pAdeno-HSV-2 gDDC)疫苗,本研究应用我们构建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗免疫小鼠,观察其对小鼠体液免疫和细胞免疫应答的影响。

材料与方法

一、材料

1.动物:4～6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠,购自广州中医药大学动物实验中心［许可证编号:SYXK(粤)2013-0092］。

2.主要试剂:HSV-2gD蛋白(美国Immune-Tech公司),羊抗小鼠HRP-IgG(武汉博士德公司),MTT(美国Sigma公司),干扰素 γ(IFN-γ)、白介素 4(IL-4)ELISA试剂盒(武汉博士德公司)。含HSV-2 gD基因的DC(pAdeno-HSV-2 gD-DC)疫苗由本实验室构建。

二、方法

1.免疫动物:40只BALB/c小鼠随机分为4组:pAdeno-DC组、pAdeno-HSV-2 gD-DC组、DC组、空白对照组,每组10只。各组每只小鼠均于腹腔注射对应DC 0.1 ml(105个),共免疫3次,每次间隔7 d。最后1次免疫后10 d,取小鼠血清及脾细胞测定免疫学指标。

2.脾细胞悬液的制备:将小鼠断椎处死后,取脾,分离单细胞悬液。然后分别用200目和400目不锈钢丝网过滤细胞悬液。用含10%小牛血清的RPMI 1640调整细胞至107/ml。

3.HSV-2 gD血清IgG抗体的检测:小鼠于免疫完成后10 d眼眶取血,ELISA法检测血清IgG水平。HSV-2型gD蛋白为包被抗原,一抗为免疫小鼠血清,二抗为羊抗鼠HRP-IgG,显色后酶标仪波长450 nm测A值。

4.脾细胞分泌IFN-γ、IL-4水平测定:用1640培养液重悬分离的脾淋巴细胞至5×106/ml,取100 μl加入96孔培养板,同时加入50 μl 1640配置的10 mg/L gD蛋白,培养72 h后,500×g离心5 min,取上清,用ELISA试剂盒检测上清IFN-γ、IL-4水平。

5.MTT法检测小鼠脾细胞增殖:用1640培养液重悬分离的脾淋巴细胞至5×106/ml,取100 μl加入96孔培养板,同时加入50 μl 1640配置的10 mg/L gD蛋白,培养72 h后,加入MTT 20 μl后37℃温育4 h,去上清,加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)振荡10 min,酶标仪490 nm测A值。刺激指数(SI)=A实验孔/A对照孔。

6.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性测定:以骨髓瘤细胞SP20为靶细胞,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定［2-3］。 取 5 × 106/ml脾细胞悬液 1.5 ml于 24 孔板,加2 mg/L植物凝血素(PHA),37℃、5%CO2培养24 h后,再加20 mg/L IL-2和2 mg/L HSV-2 gD抗原培养5 d,收集未贴壁细胞,调整至106/ml。取生长良好的SP20靶细胞于实验前用gD抗原蛋白共育过夜,10%新生牛血清(NCS)-RPMI 1640培养液洗涤并重悬至105/ml。实验设4组:靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、脾细胞自发释放孔、实验孔(效应细胞+靶细胞)。脾效应细胞为5×105/孔,效应细胞∶靶细胞=50∶1,加样于96孔板,总体积200 μl。300 ×g离心5 min,37 ℃、5%CO2培养24 h,培养结束前1 h同上离心,小心吸取上清液0.1 ml,加LDH底物混合液0.1 ml,室温下反应30 min后加0.1 mol/L柠檬酸30 μl终止反应,置BIORAD550型酶标仪测A490值。计算CTL活性,CTL细胞活性(%)=(实验孔A490值-效应细胞自发释放孔A490值-靶细胞自发释放孔A490值)(/靶细胞最大释放孔A490值-靶细胞自发释放孔A490值)×100。

结 果

见表1。pAdeno-HSV-2 gD-DC组BALB/c小鼠HSV-2 gD血清IgG抗体、脾细胞培养上清中IL-4水平、IFN-γ水平、小鼠脾细胞增殖刺激指数均高于pAdeno-DC组、DC组和空白对照组,经方差分析,差异有统计学意义(均P＜0.05);pAdeno-DC 组 、DC组、空白对照组间各检测结果经LSD法两两比较,差异无统计学意义(均P＞0.05)。

效应细胞∶靶细胞为50∶1时,pAdeno-HSV-2 gD-DC组小鼠脾脏CTL活性为37.1%,高于pAdeno-DC组(16.0%)、DC组(14.9%)和空白对照组(15.7%),经方差分析(F值为70.14),差异有统计学意义(均P＜0.05);pAdeno-DC组、DC组、空白对照组间经LSD法两两比较,差异无统计学意义(均P＞0.05)。

讨 论

HSV-2由30多种蛋白组成病毒结构蛋白,在保护HSV的DNA以及HSV的致病作用和诱导机体免疫应答中起重要作用。其中,被普遍认为有免疫原性并能诱发保护性作用的是gD糖蛋白。gD蛋白在病毒复制和刺激中和抗体的产生中起重要作用,是疫苗治疗的理想靶标之一［4］。

DC是体内最活跃、功能最强大的专职抗原提呈细胞,是细胞特异免疫应答的直接启动者和调控者。成熟的DC高表达MHC分子、协同刺激分子,并分泌多种趋化因子和细胞因子,通过抗原提呈,直接激活初始型T细胞,激活人体免疫功能［5-6］。目前DC疫苗的研究主要集中在抗肿瘤、病毒感染性疾病治疗这两个领域。传统上的抗微生物病原体疫苗是通过分离病原体弱毒株或者灭活病原体,再辅以增强免疫应答的佐剂来制备的。此类疫苗的效果取决于其是否能诱导机体产生中和性抗体。而对于一些胞内病毒感染性疾病,这种方法却不能诱导机体产生有效的保护性抗体应答,这类疾病的控制主要依赖细胞免疫。DC疫苗能激发足够强大的CTL反应,在抗病毒方面发挥巨大作用［7］。2002年,Chiriva-Internati等［8］用含 HPV16 GST-E7 基因的重组腺相关病毒转染DC,在转染后的第7天就能诱发强烈的CTL反应,腺相关病毒转染的DC与T细胞共同培养后,T细胞分泌更多的IFN-γ。 Akbar等［9］研究表明,HBsAg负载的DC疫苗比单纯蛋白疫苗诱导出数量更多的CTL。焦栓林等［10］构建了能表达HBsAg的重组腺病毒载体,转染小鼠骨髓来源的DC制备疫苗,将此DC疫苗免疫乙肝病毒转基因小鼠2次,结果表明,HBsAg重组腺病毒转染的DC能在体内有效地诱导Th1反应和特异性CTL反应。

表1 含单纯疱疹病毒2 gD(HSV-2 gD)基因的树突细胞(DC)疫苗诱发的BALB/c雌性小鼠特异性免疫应答(±s)

表1 含单纯疱疹病毒2 gD(HSV-2 gD)基因的树突细胞(DC)疫苗诱发的BALB/c雌性小鼠特异性免疫应答(±s)

注:n=3

组别 血清IgG抗体(A450值)脾细胞增殖刺激指数空白对照组 0.026±0.010 0.245±0.051 0.252±0.012 1.020±0.051 DC组 0.028±0.009 0.275±0.044 0.271±0.023 1.056±0.063 pAdeno-DC组 0.034±0.009 0.278±0.037 0.266±0.021 1.063±0.070 pAdeno-HSV-2 gD-DC组 0.313±0.034 0.544±0.043 0.568±0.031 1.600±0.215 F值 558.02 100.53 446.77 53.44 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05培养上清中IL-4(A450值)培养上清中IFN-γ(A450值)

理想的HSV疫苗应该可以诱发消除性免疫,即在HSV侵入人类机体的各种途径如生殖道、口鼻黏膜等时都能够诱发有效的免疫应答,并且对病毒的再感染具有抵抗力。Domingo等［11］构建了gD和gB多表位复合疫苗,该疫苗免疫刺激机体产生的保护效果要优于单一糖蛋白免疫的效果。徐金华等［12］将HSV-2糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP27基因融合,构建了HSV-2多表位复合疫苗,用其免疫小鼠,可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。在本实验中,我们用pAdeno-DC、pAdeno-HSV-2 gD-DC、DC免疫小鼠后,pAdeno-HSV-2 gD-DC组可以刺激血清HSV-2gD蛋白抗体的产生,诱导脾淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ、IL-4,诱发强烈的CTL反应,与pAdeno-DC组、DC组、空白对照组比较,差异均有统计学意义。IFN-γ是Th1型细胞因子,主要介导细胞免疫应答,常作为粗略反映细胞免疫的指标。本研究结果提示,我们构建的pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗可以刺激小鼠产生有效的特异性免疫应答,为其在临床的应用研究打下了基础。

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An experimental study on the immune response induced by a dendritic cell-based vaccine carrying the herpes simplex virus type 2 glycoprotein D gene in mice

Fan Jianyong，Wang Ying，Yang Huilan，Liang Jie，Li Cuihua.Department of Dermatology，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，China

Fan Jianyong，Email:fanjianyong@hotmail.com

Objective To evaluate the specific immune response induced by a dendritic cell-based adenovirus-mediated vaccine carrying the herpes simplex virus type 2 glycoprotein D gene(pAdeno-HSV-2 gD-DC)in BALB/c mice.Methods Forty BALB/c mice were equally divided into four groups:blank control group receiving no treatment，pAdeno-DC group immunized with pAdeno-DC，pAdeno-HSV-2 gD-DC group immunized with the previously constructed vaccine pAdeno-HSV-2 gD-DC，DC group immunized with DCs only.Totally，three rounds of vaccination were conducted at a 7-day interval.Ten days after the last vaccination，serum samples were collected and spleen cells were isolated from these mice.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to measure the level of IgG antibody against HSV-2 gD in the serum samples.Some spleen cells were stimulated with HSV-2 gD protein(10 mg/L)for 72 hours；then，ELISA was carried out to determine the levels of interferon(IFN)-γ and interleukin(IL)-4 in the supernatant，and 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5 diphenyl tetrazolium bromide(MTT)assay to estimate the proliferative activity of these cells.The cytotoxicity of spleen cells was also evaluated based on the measurement of lactate dehydrogenase(LDH)release.Results The serum level of IgG antibody against HSV-2 gD(given in the absorbance value at 450 nm)was 0.313 ± 0.034 in the pAdeno-HSV-2 gD-DC group，significantly higher than that in the pAdeno-DC group，DC group and blank control group(0.034± 0.009，0.028± 0.009 and 0.026± 0.010 respectively，allP＜ 0.05).Increased proliferative activity and cytotoxicity were observed in spleen cells from the pAdeno-HSV-2 gD-DC group compared with those from the pAdeno-DC group，DC group and blank control group(cell stimulation index:1.600± 0.215 vs.1.063± 0.070，1.056± 0.063 and 1.020±0.051，allP＜ 0.05；percentage of cytotoxicity:37.1%vs.16.0%，14.9%and 15.7%，allP＜ 0.05).The levels of IFN-γ and IL-4(both given in the absorbance value at 450 nm)were 0.568±0.031 and 0.544±0.043 respectively in the supernatant of spleen cells from the pAdeno-HSV-2 gD-DC group，compared to 0.266±0.021 and 0.278±0.037 respectively in the pAdeno-DC group(bothP＜0.05)，0.271±0.023 and 0.275±0.044 respectively in the DC group(bothP＜0.05)，and 0.252±0.012 and 0.245±0.051 respectively in the blank control group(bothP＜0.05).Conclusion The vaccine pAdeno-HSV-2 gD-DC could induce a specific and strong immune response in BALB/c mice.

Herpesvirus 2，human；Dendritic cells；Herpes simplex virus vaccines

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.012

国家自然科学基金(81071401)

510010广州军区广州总医院皮肤科

樊建勇,Email:fanjianyong@hotmail.com

2013-12-16)

(本文编辑:颜艳)