RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究

陈听宜 杨国玲 刘建雯 刘金鹏 张芳芳 赵晓宣

RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究

陈听宜 杨国玲 刘建雯 刘金鹏 张芳芳 赵晓宣

目的构建犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干扰载体,探讨RNA干扰载体对犬小孢子菌PQLRP基因表达的影响。方法用根癌农杆菌介导的T-DNA插入突变技术,加入多克隆位点,引入潮霉素抗性基因,先后构建PUC-PLULT、PCB309-PLULT载体。应用实时PCR方法检测PCB309-PLULT载体对犬小孢子菌PQ-LRP基因表达的干扰作用。结果构建了中间载体PUC-PLUT、PUC-PLULT,并通过PCR、基因测序进行鉴定。成功构建了长为8 825 bp的干扰载体PCB309-PLULT,并通过酶切测定为该目的载体;筛选出犬小孢子菌转化子的潮霉素最佳浓度为300 mg/L;用实时定量PCR方法对犬小孢子菌PQ-LRP基因干扰前后表达量进行鉴定:以干扰前PQ-LRP相对表达量1.0为标准,干扰后PQ-LRP相对表达量为0.39,干扰后下调61%。结论干扰载体PCB309-PLULT可以明显抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表达。

犬小孢子菌;RNA干扰;基因,PQ-LRP;基因沉默

犬小孢子菌(Microsporum canis)是较常见的致病性浅部真菌,易致儿童白癣和脓癣。对头癣流行病学调查发现,主要致病菌为犬小孢子菌［1］。本课题组前期运用抑制消减杂交技术(SSH)构建了犬小孢子菌差异基因文库［2］,通过NCBI数据库分析得到PQ loop repeat protein(PQ-LRP),并用半定量PCR证实PQ-LRP基因在儿童头皮组织中的高表达可能与犬小孢子菌的生长和致病性密切相关［3］;后期采用cDNA末端快速扩增法(RACE)获取PQ-LRP基因的cDNA全长序列,其全长为1 522 bp,开放阅读框为 1 080 bp,编码 359个氨基酸序列［4］。 基于此,本实验用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的T-DNA(transfer DNA)插入突变技术,对现有的植物双元表达载体进行修饰改造,加入多克隆位点,引入潮霉素(hygromycin)抗性基因,使其在间隔序列两侧加上目的基因的正反向干扰序列。构建并优化根癌农杆菌介导的犬小孢子菌遗传转化体系,通过基因定量分析确定构建的转化体系对犬小孢子菌PQ-LRP基因的抑制作用。

材料和方法

一、材料

1.主要试剂:潮霉素,哈尔滨赛拓生物公司生产;质粒PCB309、PUC-PUT、根癌农杆菌EHA105来自本科室;DH5α,XbaⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、BglⅢ、HindⅢ等限制性内切酶,T4DNA连接酶、Taq酶、T载体、反转录试剂盒均为宝生物工程(大连)有限公司产品;标准参照物(MarkerⅢ)、质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品。

2.菌株:犬小孢子菌脓癣株1株来自本科真菌室,分离自我科门诊就诊的5岁头癣男孩,经传统培养及ITS段PCR电泳鉴定为犬小孢子菌。

二、方法

1.引物设计:①扩增PQ-LRP基因引物:PQLRP正向:5'-CGGGGTACCCTCGAGCTTCAACATT ATCGGAGCGG-3',酶切位点:KpnⅠ,XhoⅠ;反向:5'-GAAGATCTAAGCTTTAACTGAGGGATTCGGCT AC-3',酶切位点:BglⅢ,HindⅢ;②PUC-PUT 质粒中间间隔序列引物:CUT正向:5'-TACCCACTGGAG ATTTGTTGG-3',反向:5'-CAACAAATCTCCAGTGG GTAC-3'。

2.参照RNAisoTMPlus试剂盒说明书提取总RNA［4］,用紫外分光光度计测定A260/A280比值为1.9～2.0(正常为1.8～2.0),电泳鉴定提取RNA的片段大小。然后将提取的总RNA反转录为cDNA作为PCR扩增的模板。

3.RNA干扰载体PCB309-PLULT的构建及根癌农杆菌的转化:①构建中间载体PUC-PLUT:以cDNA为模板,用引物PQ-LRP扩增PQ-LRP基因的干扰序列,得到片段长度约600 bp(反应条件:94℃预变性1 min;94℃变性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃后延伸10 min);分别将PUC-PUT和纯化回收的上述PCR片段用XhoⅠ和HindⅢ双酶切(37℃、3 h),将酶切后纯化回收的PCR片段与PUC-PUT载体进行连接(22℃、2 h),得到PUC-PLUT载体,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α,提质粒测序验证;②构建中间载体PUC-PLULT:分别将PUC-PLUT和纯化回收的上述PCR片段用BglⅢ和KpnⅠ双酶切(条件同上),将酶切后纯化回收的PCR片段与PUC-PLUT载体进行连接(条件同上),得到PUC-PLULT,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α,提质粒测序验证;③构建载体PCB309-PLULT:将质粒PUC-PLULT和PCB309分别用SpeⅠ和SacⅠ双酶切,酶切后再分别纯化回收,将从PUC-PLULT酶切并纯化的PLULT片段(3.4 kb)与酶切后纯化的PCB309载体进行连接,得到PCB309-PLULT,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α,挑取单菌落,提质粒,SpeⅠ和SacⅠ双酶切验证。用电转化方法,将干扰载体从DH5α供体菌中转入根癌农杆菌EHA105中,并用PCR鉴定干扰载体是否转入。

4.犬小孢子菌对潮霉素的敏感试验、犬小孢子菌的转化及转化子的筛选:分别配置潮霉素浓度为0、100、150、200、250、300、350、400 mg/L 的沙氏固体培养基,将犬小孢子菌悬液(分段菌丝浓度1×105～5×105个/ml)涂于培养基,28℃培养6～7 d,重复实验3次,确定潮霉素的筛选浓度为300 mg/L。取1 mlA600nm为0.6～0.8的根癌农杆菌与5×105个/ml分段菌丝1 ml混合;将200 μl混合液分别涂于添加和未添加乙酰丁香酮(AS 200 μmol/L)的诱导平板上,25 ℃避光培养 24、36、48、60、72 h［5］。 将共培养的含有根癌农杆菌和犬小孢子菌分段菌丝的混合物转移到诱导平板上(含300 mg/L潮霉素、200 μmol/L头孢噻肟钠);25℃培养4 d,直至菌落出现;将具有潮霉素抗性的犬小孢子菌转接于无潮霉素的沙氏培养基,连续传代5次后,转移至含有300 mg/L潮霉素的筛选平板上进行检测,由此获得稳定的含有干扰载体PCB309-PLULT的犬小孢子菌干扰株。

5.犬小孢子菌PQ-LRP基因mRNA表达量:用SYBR GreenⅠ荧光染料嵌合法,以干扰前犬小孢子菌的总RNA反转录获得的cDNA作为标准品，分别对各样品的PQ-LRP基因和管家基因18S用实时PCR进行定量分析,通过对管家基因的校正,对各样品PQ-LRP基因的相对表达量进行分析。

结 果

一、总RNA提取结果

提取的犬小孢子菌脓癣株总RNA用琼脂糖凝胶电泳得到完整带型(图1),适宜用于反转录。

二、RNA干扰载体PCB309-PLULT的构建

①PUC-PLUT质粒PCR鉴定:用引物PQ-LRP正向引物、CUT反向引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见约600 bp的目的片段,证明目的片段连接到PUC-PUT载体中得到载体PUC-PLUT(图2),后经测序验证正确;②PUC-PLULT质粒PCR鉴定:以引物LRP正向、CUT正向引物进行PCR扩增鉴定,可见约600 bp的目的片段,证明目的片段连接到PUC-PLUT中,得到载体PUCPLULT(图3),并经测序验证:与NCBI数据库比照,与PQ-LRP基因序列相同;③酶切片段PLULT与PCB309 PCR鉴定:载体PCB309-PLULT构建前酶切片段PLULT(3.4 kb)与 PCB309(5.4 kb)的 PCR鉴定,与预期结果相符(图5)。

图1 犬小孢子菌脓癣株总RNA提取电泳图 M:标准参照物;1,2:犬小孢子菌脓癣株RNA

图2 PUC-PLUT质粒PCR鉴定图M:标准参照物;1:阴性对照;2:PUC-PLUT

图3 PUC-PLULT质粒PCR鉴定图 M:标准参照物;1:阴性对照;2:PUC-PLUTL

图4 PCB309-PLULT质粒的根癌农杆菌转化鉴定图 M:标准参照物;1:阴性对照;2:PCB309-PLULT

图5 酶切片段PLULT与PCB309的PCR鉴定结果 M:标准参照物;1:PLULT(3.4 kb)与PCB309(5.4 kb)

三、PCB309-PLULT质粒的根癌农杆菌转化结果

构建的PCB309-PLULT质粒用电转化的方法转到根癌农杆菌EHA105中,对阳性克隆用引物LRP正向、CUT正向引物进行PCR鉴定,可见到约600 bp的片段,证明载体转入根癌农杆菌中(图4)。

四、利用实时PCR方法对犬小孢子菌PQ-LRP基因的mRNA相对表达量进行分析,结果可见,干扰后组PQ-LRP基因表达水平发生变化,以干扰前PQ-LRP相对表达量为标准1,干扰后PQ-LRP相对表达量为0.39(表1)。

表1 犬小孢子菌PCB309-PLULT干扰前、后PQ-LRP基因相对表达量

讨 论

我们用RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因进行了研究。RNA干扰技术具有高效、特异、周期短、操作简单、高通量等特点,已渐成为对真菌进行遗传改造的一种新手段［6-8］。1992年,Romano和Macino首次在粗糙脉胞菌中发现真菌中存在RNA干扰现象(当时称此现象为“基因压制”),之后Vermout等运用聚乙二醇(PEG)介导的转化体系对犬小孢子菌基因SUB3及DPPIV干扰后进行功能研究［9］。但由于真菌细胞多为多倍体且细胞壁含有较多的多糖及多糖蛋白等成分,使得干扰技术用于真菌研究过程中也存在干扰效率低、有脱靶效应等问题。所以选择适当的遗传转化方法并制备合适的转化载体,才能够更高效地导入siRNA,有效延长RNA干扰的作用时间,进而提高靶基因抑制效率,更好地对真菌进行基因研究。

RNA干扰技术中载体构建及转化是本实验研究的关键部分。已报道的载体构建方法有多种,本研究采用本真菌室设计的丝状真菌基因RNA干扰载体,构建了载体PCB309-PLULT,证明PCB309-PLULT载体适用于皮肤癣菌基因的RNA干扰研究,该方法也是首次在皮肤癣菌中得到应用。与Vermout等［9］构建载体的方法相比优点为:能够将多数研究中使用的双元载体改造为较小的双元载体,加入T-DNA边界重复序列,之后加入潮霉素抗性基因以便于筛选。根癌农杆菌是一种革兰阴性土壤杆菌,它能够将肿瘤诱导质粒上的一段T-DNA转移并随机整合到宿主基因组中,产生T-DNA插入突变。本研究成功完成了PCB309-PLULT质粒的根癌农杆菌转化,获得了干扰载体PCB309-PLULT的犬小孢子菌干扰株,并用实时PCR方法对犬小孢子菌PQ-LRP基因的mRNA相对表达量进行分析,结果显示,干扰后其基因表达水平下调61%。优化的反应体系成功地实现了对犬小孢子菌PQ-LRP基因表达的有效干扰,证明由根癌农杆菌介导的T-DNA插入突变技术具有转化受体类型多、转化效率高、转化子稳定、操作简便等优点。

PQ-LRP蛋白家族都是膜绑定蛋白,在真菌其他菌属中也被发现,但该基因的致病机理尚未见报道,本研究结果干扰载体PCB309-PLULT能够明显抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表达及犬小孢子菌干扰株的成功获得,为探讨PQ-LRP基因对菌落形态学、动物模型的建立等奠定了一定基础。

［1］余进，万喆，陈伟，等.头癣暴发的分子流行病学调查研究［J］.中华皮肤科杂志，2003，36(8):427-429.

［2］张芙蓉，张振颖，杨国玲，等.利用抑制消减杂交对犬小孢子菌在不同诱导底物表达差异基因的研究［J］.中国皮肤性病学杂志，2009，23(1):20-23.

［3］张振颖，祝逸平，杨国玲.儿童头皮及光滑皮肤组织对体外培养犬小孢子菌PQ-LRP表达水平的影响［J］.中国皮肤性病学杂志，2011，25(2):107-109.

［4］庞娟，祝逸平，杨国玲.犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA的克隆［J］.中华皮肤科杂志，2012，45(2):138-139.

［5］Zhang YH，Li GQ，He D，et al.Efficient insertional mutagenesis system for the dimorphic pathogenic fungusSporothrix schenckiiusingAgrobacterium tumefaciens［J］.J Microbiol Meth，2011，84(3):418-422.

［6］Rappleye CA，Engle JT，Goldman WE.RNA interference inHistoplasma capsulatumdemonstrates a role for alpha-(1，3)-glucan in virulence［J］.J Mol Microbiol，2004，53(1):153-165.

［7］Sommer U，Liu H，Doering TL.An alpha-1，3-mannosyltransferase ofCryptococcus neoformans［J］.J Biol Chem，2003，278(48):47724-47730.

［8］Mouyna I，Henry C，Doering TL，et al.Gene silencing with RNA interference in the human pathogenic fungusAspergillus fumigatus［J］.FEMS Microbiol Lett，2004，237(2):317-324.

［9］Vermout S，Tabart J，Baldo A，et al.RNA silencing in the dermatophyteMicrosporum canis［J］.FEMS Microbiol Lett，2007，275(1):38-45.

PQ-loop repeat protein gene silencing by RNA interference inMicrosporum canis

Chen Xinyi，Yang Guoling，Liu Jianwen，Liu Jinpeng，Zhang Fangfang，Zhao Xiaoxuan.Department of Dermatology and Venereology，First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China

Yang Guoling，Email:yanggl@medmail.com.cn

Objective To build a RNA interference vector for PQ-loop repeat protein(LRP)gene，and to evaluate the effect of the vector on the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canis.Methods The PUC-PLULT and PCB309-PLULT vectors were constructed sequentially by usingAgrobacterium tumefaciens-mediated T-DNA insertional mutagenesis，adding multiple cloning sites，and introducing the hygromycin-resistance gene.Microsporum caniswas transformed with the PCB309-PLULT vector followed by a series of passages and hygromycin selection.Real-time quantitative PCR was performed to measure the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canisbefore and after transformation.Results The intermediate vectors PUC-PLUT and PUC-PLULT were constructed and identified by PCR and gene sequencing.The 8 825-bp interference vector PCB309-PLULT was successfully built and confirmed by enzyme digestion.The optimum concentration of hygromycin for screening forMicrosporum canistransformants was determined as 300 mg/L.The mRNA expression level of PQ-LRP was decreased by 61%in the transformants as compared with untransformedMicrosporum canis(0.39 vs.1.00).Conclusion The constructed PCB309-PLULT interference vector can effectively inhibit the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canis.

Microsporum canis；RNA interference；Genes，PQ-LRP；Gene silencing

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.007

国家自然科学基金(81071330)

116011大连医科大学附属第一医院皮肤性病科

杨国玲,Email:yanggl@medmail.com.cn

2013-11-20)

(本文编辑:吴晓初)