生殖支原体对大环内酯类抗生素耐药突变位点研究

刘排 蒋娟 张津萍 尢永燕 沙仲 孙厚华 龚匡隆 孙建方

生殖支原体对大环内酯类抗生素耐药突变位点研究

刘排 蒋娟 张津萍 尢永燕 沙仲 孙厚华 龚匡隆 孙建方

目的了解生殖支原体对大环内酯类抗生素耐药相关的23S rRNA基因突变情况。方法就诊于我院性病门诊的91例近期应用过大环内酯类药物治疗的持续性和复发性尿道炎患者,取尿道拭子和前段尿标本进行生殖支原体(Mg)、沙眼衣原体(Ct)、解脲脲原体(Uu)等病原体检测,筛选出单一生殖支原体阳性患者标本,应用套式PCR扩增与大环内酯类抗生素耐药性相关的23S rRNA基因V区片段,扩增产物进行DNA测序,测得序列与美国国立生物信息中心已登记的生殖支原体标准株G37的相应基因序列比对。结果91例的标本中,Mg阳性21例,Ct阳性18例(19.8%),Uu阳性10例,Mg与UU同时阳性2例,Ct与Uu同时阳性3例,Mg、Ct和Uu检测均为阴性者37例。21例Mg阳性标本中,18例的标本成功扩增出23S rRNA基因V区片段,除1例未发现基因突变外,其余17例均发现2058和2059位点突变,其中A2059G突变10例,A2058G突变5例,A2058T突变2例。结论23S rRNA基因V区片段基因突变可能与南京及周边地区Mg对大环内酯类药物耐药性相关。

支原体,生殖器;抗药性,细菌;抗菌药

生殖支原体(Mycoplasma genitalium，Mg)是男性非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)的重要病因之一,特别是在男性非衣原体非淋菌性尿道炎中Mg的患病率更高［1］。目前,国外性传播疾病(STD)治疗指南推荐大环内酯类抗生素作为治疗Mg阳性NGU的一线方案［2］,但对其耐药的Mg菌株已经在澳大利亚、瑞典和挪威的患者中分离出来［3-4］。研究发现,与大环内酯类抗生素耐药性相关的基因突变位于23S rRNA基因V区。本研究对就诊于我院性病科门诊Mg阳性的男性NGU患者Mg进行耐药相关突变位点检测。

对象与方法

一、对象

2012年4-9月就诊于中国医学科学院皮肤病医院性病科门诊的男性NGU患者。入选标准:①年龄满18周岁;②近2个月内具有持续性或复发性尿道炎史;③近1个月内曾使用大环内酯类抗生素(阿奇霉素、克拉霉素或罗红霉素);④首次接受治疗至本次就诊期间无性生活;⑤就诊时具有尿痛、尿路不适、排尿困难、尿道分泌物等尿道炎症状;⑥尿道拭子涂片革兰染色镜检多形核白细胞计数(PMNL)≥5/每油镜视野;⑦无前列腺炎史(无典型临床症状或实验室证据)。排除标准:①尿道拭子涂片或培养淋球菌阳性者;②HIV感染者。

二、方法

1.抽样与标本采集:本研究通过中国医学科学院皮肤病医院伦理委员会审查同意。采用方便抽样方法入选研究对象,所有研究对象签署知情同意书后进行体检和标本采集。每例患者采集3根尿道拭子和10 ml前段尿。第1根拭子用于革兰染色涂片、中性粒细胞计数及排除淋球菌性尿道炎;第2根拭子立即接种于解脲脲原体液体培养基用于检测解脲脲原体(Uu);第3根拭子立即冻存于-20℃,供沙眼衣原体(Ct)荧光定量PCR之用。前段尿标本立即冻存于-70℃,供生殖支原体PCR检测之用。

2.主要试剂与仪器:淋球菌培养基(珠海迪尔生物工程有限公司)、解脲脲原体液体培养基(法国BioMerieux公司)、沙眼衣原体核酸检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)。PCR反应酶GoTaq® Green Master Mix(美国Promega公司)、GeneAmp 9700 PCR仪(美国ABI公司)、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

3.淋球菌、沙眼衣原体及解脲脲原体检测:检测操作流程严格按照检测试剂盒说明书进行。

4.生殖支原体检测:DNA提取采用Chelex-100树脂(美国Oxide公司)法,按照文献［5］方法进行。生殖支原体检测采用套式PCR方法,按照文献［6］进行。阳性扩增产物纯化后全部送上海英骏生物技术有限公司进行双向测序,并将测序结果与Genbank中的提交序列进行BLAST比对。

5.生殖支原体23S rRNA基因V区片段扩增:Mg阳性标本中Mg 23S rRNA基因V区片段扩增采用套式PCR方法,外套引物为Mg23S-1986f(5'-GTGTAACCATCTCTTGACTGTCTCGG-3')和Mg23S-2171r(5'-TTCACATCAACAAATCCTTGCGA-3'),内套引物为Mg23S-1992F(5'-CCATCTCTTGACTGTC TCGGCTAT-3')和Mg23S-2138R(5'-CCTACCTATT CTCTACATGGTGGTGTT-3')。外套PCR反应体系:5 μl模板加入20 μl反应液(其中包括上下游引物各 0.5 μmol/L,dNTP 各 200 μmol/L,Taq DNA 聚合酶1 U)中。外套PCR循环:95℃预变性2 min,然后按95℃45 s,58℃60 s,72℃60 s共35个循环,最后72℃延长5 min。外套扩增产物用超纯水稀释10倍,取1 μl作为内套模板,加入50 μl反应液。内套PCR循环:95℃预变性2 min,然后按95℃45 s,55℃ 30 s,72℃30 s共35个循环,最后72℃延长5 min。套式PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L EB)电泳,凝胶成像观察并记录结果。扩增产物预期片段为147 bp。阳性扩增产物纯化后全部送上海英骏生物技术有限公司进行双向测序。将测序结果与Genbank中的提交序列进行BLAST比对。

结 果

一、人口学资料和STD病史

共调查门诊尿道炎患者264例,91例符合入选标准。年龄18～69岁,平均年龄37.0岁。尿道炎病程7～60 d,平均20.2 d。曾使用过一种大环内酯类抗生素(阿奇霉素、克拉霉素或罗红霉素)治疗的有37例(40.7%),曾使用过两种及以上大环内酯类抗生素治疗的有54例(59.3%)。

二、STD检测结果

所有91例均提供标本进行病原体检测,54例(59.3%)检测到至少1种病原体,其中Mg 21例(23.1%),Ct 18例(19.8%),Uu 10例(11.0%),Mg+Uu 2例(2.2%),Ct+Uu 3例(3.3%),Mg、Ct、Uu均阴性37例(40.7%),无Mg+Ct及Mg+Ct+Uu病例。

三、Mg 23S rRNA基因V区片段扩增结果

21例Mg阳性标本进行23S rRNA基因V区片段扩增,其中18例成功扩增出目的基因片段,获得147 bp大小片段,见图1。

四、Mg 23S rRNA基因V区片段扩增产物测序和比对结果

18例Mg阳性标本扩增产物测序结果与GenBank中的提交序列进行BLAST比对后发现,除1例未发现23S rRNA基因核苷酸点突变外,其余17例均存在23S rRNA基因核苷酸点突变,其中A2059G突变10例,A2058G突变5例,A2058T突变2例。测序峰图见图2～5。

讨 论

Mg是近年来逐渐被人们所认识到一种病原体,许多研究证明,Mg是男性NGU的重要病因［7-8］。由于Mg缺乏细胞壁,作用于细胞壁的抗生素,如青霉素类,对其无效。临床上多采用干扰蛋白质合成的药物如大环内酯类药物,以及干扰DNA复制的药物如喹诺酮类药物治疗Mg感染。研究表明,阿奇霉素5 d疗法(首日500 mg,第2～5天250 mg/d)对Mg感染患者的清除率较高。因此,国外STD治疗指南将大环内酯类药物作为目前治疗Mg感染的一线方案。

然而随着大环内酯类药物广泛应用于治疗Mg感染,近年来关于其耐药的报道也越来越多。Bradshaw等［3］采用阿奇霉素1 g顿服方案、或者1 g每周1次口服共3次的方案治疗Mg阳性的男性NGU患者,发现高达28%的患者Mg持续阳性,分离治疗失败患者体内的临床株进行体外药敏试验,结果发现,对阿奇霉素的最低抑菌浓度(MIC)升高,提示其对阿奇霉素的敏感性降低。最近的几项研究中［9-10］,阿奇霉素1 g单剂量疗法对患者Mg感染的清除率仅为67%～84%,这一现象可能反映了人群中已经存在对大环内酯类抗生素具有耐药性的Mg,也可能反映了阿奇霉素诱导Mg对大环内酯类抗生素耐药性的出现。

图1 生殖支原体23S rRNA基因V区片段扩增产物电泳图1:100 bp DNA标准参照物;2、3:生殖支原体临床阳性标本,147 bp;4:G37标准株,147 bp;5:阴性对照(ddH2O),无扩增

图2 生殖支原体G37标准株23S rRNA基因V区片段序列峰图

图3 A2059G突变生殖支原体临床株23S rRNA基因V区片段序列峰图

图4 A2058G突变生殖支原体临床株23S rRNA基因V区片段序列峰图

图5 A2058T突变生殖支原体临床株23S rRNA基因V区片段序列峰图

细菌对大环内酯类药物的耐药机制包括靶位点突变、靶位甲基化修饰、主动外排机制、核糖体蛋白突变和钝化酶等。目前研究发现,支原体对大环内酯类药物的耐药机制主要为基因突变导致的靶位点改变,这些研究主要集中在肺炎支原体和解脲支原体［11-12］。这些研究发现,对大环内酯类药物耐药突变位点主要位于23S rRNA基因和核糖体蛋白基因L4和L22基因。目前关于生殖支原体对大环内酯类药物耐药机制的研究较少。Jensen等［4］对7株从阿奇霉素治疗失败的男性Mg相关尿道炎的患者体内获得的菌株进行体外大环内酯类抗生素的药物敏感试验,研究Mg对大环内酯类抗生素的耐药分子机制。研究发现,Mg23S rRNA V区位于2 058和2 059位点的点突变与Mg对阿奇霉素的耐药性相关。耐药性导致非剂量依赖性的大环内酯类抗生素治疗失败,而且耐药性可能是由于阿奇霉素单剂量顿服治疗方案的不足量诱导的。研究者认为,Mg对阿奇霉素耐药性主要是由于在没有弄清NGU的真正病原菌前提下给予阿奇霉素单剂量治疗所诱导的。尽管在其他柔膜细菌中发现L4和L22基因区突变位点与大环内酯类抗生素耐药性相关,该研究发现L4基因许多点突变发生,但是大多数并不导致氨基酸改变,因此不能解释与耐药相关。近来,新西兰和日本学者的研究［13-15］也发现,23S rRNA基因A2059G突变与Mg对大环内酯类抗生素的耐药性相关。同时,通过对治疗前后尿液标本中Mg进行基因分型发现,发生耐药基因突变的Mg菌株都是来自于治疗前未发生耐药基因突变的高度相近的或完全相同的菌株,是经过阿奇霉素治疗选择而来。因此,23S rRNA基因位点突变可能是介导Mg对大环内酯类药物耐药性的主要机制,阿奇霉素单剂量治疗方案可能会诱导Mg对大环内脂类抗生素耐药性的产生。

本研究对91例持续性和复发性NGU患者病原体进行检测发现,除37例(40.7%)未检测到病原体外,Mg感染(25.3%)和Ct感染(23.1%)是最常见的病原菌。Mg、Ct和Uu检测均阴性的患者可能是由于神经精神因素、变态反应因素等非感染性因素引起,也可能是由于阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒或其他临床少见病原体感染所致［16-17］。

本研究91例患者均为近期接受大环内酯类抗生素治疗失败的患者,且患者自接受治疗至本次就诊期间无性生活,排除了治疗后再感染的可能。因此,标本检测Mg阳性可能是由于其对大环内酯类药物耐药所致。本研究21例Mg阳性标本中,18例成功扩增出目的基因片段,除1例未发现基因突变外,其余17例均存在23S rRNA基因核苷酸点突变。与既往国外研究结果类似,本研究中耐药基因突变位点位于2058和2059位点,其中A2059G突变10例,A2058G突变5例,A2058T突变2例,未发现其他位点的突变,提示引起南京及周边地区STD门诊Mg耐药的主要机制可能是23S rRNA基因V区的点突变,2059位点突变占主导位置。A2058T突变为本研究首次发现,其在Mg对大环内酯类药物耐药性中的具体作用有待于进一步研究证实。既往有研究报道,Mg耐药可能与核糖体蛋白L4和 L22 基因突变相关［4，14-15］,但是其突变与 A2058G或A2059G同时发生,不足以证明与大环内酯类耐药性相关。同时,肺炎支原体耐药性研究发现,与23S rRNA基因V区突变相比,L4和L22突变仅可能与低水平耐药相关。因此,本研究未对L4和L22基因位点突变进行研究。

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Detection of point mutations associated with macrolide resistance inMycoplasma genitalium

Liu Pai，Jiang Juan，Zhang Jinping，You Yongyan，Sha Zhong，Sun Houhua，Gong Kuanglong，Sun Jianfang.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s:Jiang Juan，Email:drjjiang@vip.163.com；Sun Jianfang，Email:sunjf57@163.com

Objective To detect point mutations associated with macrolide resistance in the 23S rRNA gene ofM.genitalium.Methods Ninty-one patients with persistent or recurrent urethritis，who had been treated with macrolides in the past one month but achieved no obvious improvement，were included in this study.Urethral swab and first-void urine samples were collected from these patients.Gram's staining，culture and fluorescence-based quantitative PCR were carried out to detectNeisseria gonorrhoeae，Ureaplasma urealyticumandChlamydia trachomatisrespectively in these urethral swab samples，and PCR was performed to detectM.genitaliumin the urine samples.For patients positive to onlyM.genitalium，nested PCR was conducted to amplify the domain V of the 23S rRNA gene followed by direct automatic sequencing，and the resulting sequences were compared to the corresponding sequences ofM.genitaliumG37 strain submitted to the National Center for Biotechnology Information.Results Of the 91 patients，21 were positive forM.genitalium，18 forC.trachomatis，10 forU.urealyticum，2 for bothM.genitaliumandU.urealyticum，3 for bothC.trachomatisandU.urealyticum，and 37 for none of the tested pathogens.The domain V of the 23S rRNA gene，which was amplified from 18 of the 21M.genitalium-positive samples，carried an A to G transition at position 2059 in 10 samples，an A to G transition at position 2058 in 5 samples，an A to T transition at position 2058 in 2 samples，but no point mutations in 1 sample.Conclusion The point mutations in domain V of the 23S rRNA gene may contribute to macrolide resistance inM.genitaliumin Nanjing and its surrounding areas.

Mycoplasma genitalium；Drug resistance，bacterial；Anti-bacterial agents

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.005

210042南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所

蒋娟,Email:drjjiang@vip.163.com;孙建方,Email:sunjf57@163.com

2013-11-13)

(本文编辑:颜艳)