采后ASM处理对苹果果实抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统的影响

李灿婴，葛永红，* ，朱丹实，靳韪华

(1．渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013;2．甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070)

由扩展青霉(Penicillium expansum)侵染引起的青霉病是苹果贮藏期间的主要侵染性病害之一，在贮藏中后期腐烂发生率较高［1］。目前主要依靠人工合成的杀菌剂如甲基托布津、苯来特、多菌灵等来防止果实采后病害的发生。由于杀菌剂残留、环境污染及诱导病原物产生抗药性等问题，因此开发新型、安全的采后病害防治技术是当前生产中亟待解决的问题［2-3］。

苯丙噻重氮(acibenzolar-S-methyl，ASM)属水杨酸类似物，其本身对病原菌生长没有直接的抑制，而是通过激发果实体内的系统抗性来提高抗病性［4］。ASM不仅可以有效地减轻苹果、甜瓜、番茄等多种果蔬的田间病害，而且还可降低苹果、梨、芒果、葡萄、甜瓜等果蔬的采后病害［5-7］。ASM诱导果实抗病性的机理主要涉及活性氧代谢、活化苯丙烷代谢及产生病程相关蛋白等［4］。ASM处理使鸭梨果实具有较高的苯丙氨酸解氨酶(PAL)和几丁质酶(CHT)活性，积累了较高水平的H2O2和酚类物质［8］。“象牙”和“台农”2个品种芒果用ASM处理后产生速率、H2O2含量都明显高于对照［9］，采后ASM处理还能诱导甜瓜果实活性氧的积累［10］。但有关ASM处理对苹果青霉病控制的报道很少，并且对于ASM处理后抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统的变化研究不够深入。

本实验以苹果为试材，通过采后ASM浸泡处理对果实损伤接种P．expansum，测量常温贮藏期间果实的病斑直径，研究其对苹果青霉病的控制效果，并探讨其对抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统中主要酶活性和抗氧化剂含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验用富士苹果2012年9月采自景泰县条山农场，在八成熟时采收，纸箱包装后当天运回实验室进行处理。供试 ASM由 Novatis公司提供(有效浓度50%)。

P．expansum分离自自然腐烂的苹果果实，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基25℃培养待用。

UV-2450型分光光度计 日本岛津;H-1850R型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;WYX-A微型旋涡混合器 上海跃进医疗器械厂。

1.2 实验方法

1．2．1 处理方法 苹果用2%次氯酸钠浸泡消毒后用自来水冲洗净果实表面并晾干后均分两份，每份90个果实，然后分别用自来水(内含 0．05%的Tween80)和 100mg·L-1的 ASM 溶液(内含 0．05% 的Tween80)浸泡10min后捞出晾干表面水分装箱待用。

1．2．2 孢子悬浮液的配制 参照 Bi等的方法［11］。取25℃下培养7d的带菌PDA平皿一个，加入含0．05%Tween80的无菌水约10mL，用玻璃棒刮下PDA平板上的P．expansum孢子，然后转入50mL三角瓶中，在WYX-A微型旋涡混合器上振荡15s，再用双层纱布过滤，滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的浓度，稀释至1×105个·mL-1。

1．2．3 损伤接种 参照 Ge等的方法［7］。选取自来水和ASM处理后常温贮藏24h的果实，经75%酒精表面消毒后，用灭菌铁钉在果实表面等距离刺孔4个(深3mm，直径3mm)。取10μL孢子悬浮液分别接入孔内。晾干后入包装箱，室温贮藏观察发病率，用十字交叉法测定病斑直径。

1．2．4 取样 参照 Bi等的方法［11］。分别于处理后第2、4、6、8、10d 用直径 5mm 打孔器取果实皮下10～15mm处果肉组织3g，用锡箔纸包好，液氮速冻后，在-80℃超低温冰箱中保存待用。每次取样用10个果实。

1．2．5 H2O2含量测定 H2O2参照 Patterson等方法并修改［12］。H2O2反应体系包括 1mL 上清液，0．1mL 20%的四氯化钛(溶于浓盐酸，V/V)，0．2mL浓氨水，在508nm处测定吸光值。以H2O2溶液制作标准曲线，H2O2含量以μmol H2O2·g-1FW表示。

1．2．6 过氧化氢酶(CAT)活性测定 参照Ren等方法［10］。以每分钟 OD 值变化0．01为1U，CAT的活性表示为U·g-1FW。

1．2．7 抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定 参照Nakano和Asada方法并修改［13］。酶促反应体系由2mL 100mmol·L-1磷酸缓冲液(pH7．5，含 1mmol·L-1EDTA)，0．8mL 3mmol·L-1抗坏血酸，200μL 粗酶液和0．5mL H2O2(0．5mmol·L-1)组成，最后加入 H2O2启动酶促反应。在290nm的吸光度值，连续测定2min。以每分钟 OD值变化 0．01为 1U，酶活性表示为U·g-1FW。

1．2．8 谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定 参照Halliwell和 Foyer方法并修改［14］。酶促反应体系由3mL、100mmol·L-1的磷酸缓冲液，0．1mL、5mmol·L-1氧化型谷胱甘肽(GSSG)，30μL、3mmol·L-1NADPH和0．2mL酶液组成(最后加入 NADPH启动酶促反应)。在340nm的吸光度值，连续测定2min。以每分钟OD值变化0．01为1U，以U·g-1FW表示。

1．2．9 单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性测定 参照Nakano和Asada的方法并修改［13］。DHAR 反应体系包含 2mL、40mmol·L-1磷酸缓冲溶液(pH8．0)，300μL、0．1mmol·L-1EDTANa2，400μL、2mmol·L-1还原型谷胱甘肽 (GSH)，400μL、0．5mmol·L-1DHA 和 100μL 粗酶液，混匀后立即记录290nm处的OD值，以每分钟变化0．01为1U，以U·g-1FW表示DHAR的活性。

MDAR 反应体系包括 2mL、40mmol·L-1磷酸缓冲溶液(pH8．0)，0．2mL、10mmol·L-1抗坏血酸钠，0．1mL、40μmol·L-1硫酸铜，0．5mL 粗酶液，最后加入0．2mL、0．2mmol·L-1NADPH 启动酶促反应，混匀后立即记录340nm处的OD值，以每分钟OD值变化0．01为1U，以U·g-1FW表示MDAR的活性。

1．2．10 抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定 AsA含量测定参照Tanaka等的方法并修改［15］。反应体系包括提取液 200μL，150mmol·L-1磷酸缓冲液(pH7．4)500μL，10%TCA 400μL，44%磷酸400μL，4%2，2-二联吡啶(溶于 70% 乙醇)400μL，3%FeCl3200μL。反应混合液 37℃温浴 60min，测525nm处吸光度。标准曲线用L-AsA标定。AsA含量以 μg AsA·g FW-1表示。

GSH含量的测定参照Ren等方法并修改［10］。反应体系由 1mL 上清液，1mL 0．1mol·L-1的磷酸缓冲液(pH7)，0．5mL 4mmol·L-1DTNB 溶液(由 0．1mol·L-1，pH7的磷酸缓冲液配制)组成。将混合液于25℃下保温反应10min后，在412nm处测定吸光度值。用GSH制作标准曲线，GSH含量用μmol GSH·g FW-1表示。

1.3 数据分析

全部实验数据用Microsoft Excel 2007以及SPSS16．0软件进行数据统计分析。并计算标准偏差(±SE)或进行LSD分析。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 采后ASM处理对果实损伤接种P.expansum病斑直径的影响

图1 采后ASM处理对苹果损伤接种P．expansum病斑直径的影响Fig．1 Effect of postharvest ASM treatment on lesion diameter in apple fruit inoculated with P．expansum

ASM处理后24h接种 P．expansum，果实从接种后第3d开始明显发病，发病率达到100%，并且随着贮藏时间的延长病斑直径逐渐增大，但是ASM处理果实的病斑直径显著低于(p≤0．05)对照，如在贮藏第 5、6d 分别低于对照 8．8%和 7．1%(图 1)。

2.2 ASM处理对苹果果实H2O2含量的影响

在贮藏期间苹果果实中H2O2含量总体呈先升高后下降的趋势，采后ASM处理明显提高了果实H2O2含量，并且促进了H2O2含量高峰的提前出现，在第6d达到最大，是对照的1．34倍(图2)。

图2 采后ASM处理对果实H2O2含量的影响Fig．2 Effect of postharvest ASM treatment on the content of H2O2

2.3 ASM处理对苹果果实CAT活性的影响

对照苹果果实在贮藏期CAT活性呈先缓慢升高后下降趋势，ASM处理抑制了果实CAT活性的升高，在整个贮藏期均低于对照(图3)，如贮藏第4d，处理果实CAT活性低于对照24．8%。

2.4 ASM处理对苹果果实APX活性和AsA含量的影响

在整个贮藏期间，APX活性呈先上升后下降趋势，并且ASM处理显著提高了果实APX活性，贮藏第6d出现高峰(图4A)。由图4B可知，采后ASM处理显著增加了果实中AsA含量，并且在贮藏第6d达到最大，而对照果实AsA含量没有明显的高峰出现。

2.5 ASM处理对苹果果实MDAR和DHAR活性的影响

图3 采后ASM处理对苹果果实CAT活性的影响Fig．3 Effect of postharvest ASM treatment on the activity of CAT

图4 采后ASM处理对果实APX(A)活性和AsA(B)含量的影响Fig．4 Effect of postharvest ASM treatment on APX(A)activity and AsA(B)content

随着贮藏时间的延长，对照和ASM处理苹果果实中MDAR活性呈先升高后下降趋势，ASM处理显著提高了MDAR活性，并且在第4d达到最大，高出对照23．1%(图 5A)。DHAR活性的变化趋势和MDAR基本一致，ASM处理显著提高了苹果果实中DHAR活性，在贮藏第6d达到最大，高出对照28．2%(图5B)。

2.6 ASM处理对苹果果实GR活性和GSH含量的影响

GR活性总体呈现先升高后降低的趋势，ASM处理明显提高了苹果果实GR活性，并且在贮藏第6d达到最大(图6A)。对照和ASM处理果实GSH含量均呈先上升然后缓慢下降的趋势，处理果实在贮藏第6d达到最大，GSH含量是对照的1．24倍(图6B)。

3 讨论

图5 采后ASM处理对果实MDAR(A)和DHAR(B)活性的影响Fig．5 Effect of postharvest ASM treatment on MDAR(A)and DHAR(B)activities

图6 采后ASM处理对果实GR(A)活性和GSH(B)含量的影响Fig．6 Effect of postharvest ASM treatment on the activity of GR(A)and GSH(B)content

本实验发现采后100mg·L-1ASM处理显著降低了苹果果实损伤接种P．expansum的病斑直径，这种抗病性的提高可能与ASM诱导的果实体内活性氧代谢有关。研究表明，ASM 处理诱导了梨［8］、桃［16］、甜瓜［10］、芒果［17］等果实的抗病性，并且促进了活性氧的积累。本实验发现采后ASM处理诱导了苹果果实体内H2O2含量的提高，并且抑制了CAT活性。在梨、甜瓜桃、芒果等果实体内也发现了类似的现象［10，16-18］。ASM 诱导的 H2O2的积累主要发生在处理后的早期，其积累与细胞膜的完整性密切相关，并且含量受果实体内抗氧化酶和抗氧化剂含量的影响［10，16-17，19］。CAT 可以专一地作用于 H2O2，将 H2O2分解为H2O和O［20］2，本实验发现，ASM处理抑制了果实CAT活性，从而促进了果实体内H2O2的积累。果实体内H2O2含量的提高有以下几方面的作用，可以直接杀死侵染的病原物，作为信号分子启动其他防卫反应，参与细胞壁结构的木质化及结构蛋白的交联等。

AsA-GSH循环是果实体内直接清除ROS的酶促催化系统，在此过程中，APX以AsA为基质将H2O2转变成H2O，同时产生两分子活泼的MDHA，MDHA在 MDHAR存在时可以还原为 AsA，同时MDHA又能够进一步氧化形成 DHA，而 DHA在DHAR存在的情况下能够以GSH为底物又还原成AsA，同时 GSH被氧化为 GSSG，GSSG又可以以NADPH为电子供体，通过GR的催化再重新还原成GSH，因而APX和GR是此循环中的两个关键酶，可以保持果实体内AsA和GSH的平衡，并在抗氧化系统中发挥着重要的作用［21-22］。本实验结果显示，ASM处理提高了果实APX和GR活性，从而提高了果实活性氧的清除能力。AsA和GSH是AsA-GSH循环中两个重要的抗氧化物质，本身具有直接清除ROS的作用［21-22］。本实验结果表明，ASM处理能够使果实的AsA和GSH含量保持在相对较高的水平，并且保持了较高的MDAR和DHAR活性，从而促进了AsA-GSH循环运转的效率，有效维持了AsA和GSH的循环系统，进而维持了较高抗氧化能力，使过量的ROS能够及时的被清除。

4 结论

采后100mg·L-1ASM处理显著降低损伤接种苹果果实P．expansum的病斑直径，抑制了果实体内CAT活性，从而提高果实H2O2含量。同时ASM处理通过提高AsA-GSH循环系统中抗氧化酶活性和抗氧化剂水平消除过量H2O2对果实伤害。

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