两种热量限制方式对SH-SY5Y细胞氧化损伤作用的比较

陈 娟 张景燕 王 蓉 赵静姝 郭 瑾 王玉兰 张 旭

(首都医科大学宣武医院中心实验室 北京老年病医疗研究中心 神经变性病教育部重点实验室，北京100053)

热量限制(CR)是指有计划的减少由食物提供的热量，一般是在保证足够的维生素和矿物质水平下，将正常自由进食所得的热量减去30% ～50%〔1〕。老年痴呆成为威胁人类健康的主要疾病之一。研究表明，CR具有提高认知及记忆能力、延缓退行性疾病的发生及发展、延缓衰老等有利作用，其中，抗氧化应激损伤是作用机制之一〔2〕。目前，用于体内研究的CR方法有很多，如减少食物中脂类、糖类物质的比例，也有用药物干预如白藜芦醇等〔3〕。本实验旨在通过降低培养液中细胞的主要能量消耗来源葡萄糖的方式和白藜芦醇模拟CR作用，建立SH-SY5Y细胞CR模型，对比两种方法对 H2O2诱导的 SHSY5Y细胞损伤的保护效果。

1 材料和方法

1.1 材料 人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞来自瑞典卡罗林斯卡医学院。噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司，二甲基亚砜(DMSO)购自北京亚太精细化工公司，乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自北京化工厂，编号001012，30%H2O2购自北京化工试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 细胞用DMEM×F12(Gibco)培养基培养(3.0 g/L-葡萄糖)，加入10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml、链霉素100 IU/ml于37℃，5%CO2培养箱中培养。贴壁细胞生长密度达到70% ～80%时，分组处理:对照组及损伤组，DMEM×F12(3.0 g/L-葡萄糖)加入1%胎牛血清，培养24 h;低糖组及低糖+损伤组，换用低糖组培养基为DMEM(2.0 g/L-葡萄糖)加1%胎牛血清，培养24 h;白藜芦醇组和白藜芦醇+损伤组，换用DMEM×F12(3.0 g/L-葡萄糖)加入1%胎牛血清及不同浓度的白藜芦醇，培养24 h;预处理后予以250 μmol/L的H2O2分别损伤1 h和7 h。用于后续实验。

1.2.2 MTT代谢率测定 将SH-SY5Y细胞接种于96孔板中，细胞接种密度1.0×104/孔，待细胞贴壁生长至70% ～80%时予以相应处理，加入MTT溶液(5.0 g/L)20 μl继续培养4 h后，弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO作用10 min后，用全波长酶标仪(Multiskan Spectrum)测定570 nm处光密度值。

1.2.3 细胞形态观察 将SH-SY5Y细胞以2×102/ml接种于6孔板(Costar产品)中，分为对照组(3.0 g/L-葡萄糖)、损伤组(250 μmol/L H2O2)、低糖组(2.0 g/L-葡萄糖)、低糖+损伤组、白藜芦醇(1.25、5 μmol/L)组、白藜芦醇(1.25 μmol/L)+损伤组，处理方式同前，用倒置显微镜(Olympus产品)观察细胞形态的改变。

1.2.4 LDH漏出率测定 细胞培养方法同前，按照比色法，测定570 nm处光密度值，同时做表。

1.3 统计学分析 采用SPSS11.5软件统计进行方差分析。

2 结果

2.1 MTT代谢率测定 对照组细胞活力为(0.762±0.016)，用低糖和白藜芦醇预处理细胞24 h，低糖组细胞活力上升(0.847±0.013，P ＜0.01);白藜芦醇1.25 μmol/L 组活力稍上升，但无统计学差异(0.768±0.016，P＞0.05);白藜芦醇5 μmol/L组活力下降(0.685 ±0.019)。用250 μmol/L H2O2分别处理1 h和7 h，低糖+损伤组在1 h和7 h活力都上升;而白藜芦醇+损伤组在损伤1 h时活力上升，但是在作用7 h后活力明显下降。见表1。

2.2 LDH漏出率测定结果 损伤1 h后结果显示，与对照组相比，损伤组漏出率明显增加(1.368±0.101 vs 1.249±0.079，P＜0.05)，低糖组、白藜芦醇组漏出率稍有减少，但无统计学差异(1.163±0.052，1.198±0.071，P ＞0.05);与损伤组比较，低糖+损伤组漏出率明显减少(1.143±0.047，P＜0.01)，白藜芦醇+损伤组漏出率减少(1.251±0.067，P＜0.05)。继续培养至7 h显示，低糖组漏出率由增加至(1.223±0.107)，增加了5%;低糖+损伤组漏出率增加至(1.262±0.081)，增加了11%;白藜芦醇+损伤组由显著增加至(1.863±0.165)，增加了48%(P＜0.01);白藜芦醇+损伤组漏出率高于低糖+损伤组(P＜0.01)。

2.3 细胞形态学观察 未加损伤之前，低糖组细胞形态，与空白组比较无明显改变，加入损伤药物1 h后，各组细胞形态与空白组比较无明显改变，加入7 h后，低糖组、低糖组+损伤组和空白组。细胞突起伸展良好细长，白藜芦醇+损伤组可见细胞数目明显减少，死细胞多，细胞突起回缩，细胞明显变圆，贴壁性不好，透光性差。见图1。

表1 用250 μmol/L H2O2分别处理1 h和7 h各组细胞活力(s)

表1 用250 μmol/L H2O2分别处理1 h和7 h各组细胞活力(s)

与对照组及损伤组比较:1)P＜0.01

0.302 2±0.001 0.537 2±0.007损伤组 0.204 8±0.003 0.147 7±0.001低糖组 0.446 4±0.0081) 0.582 7±0.0061)低糖+损伤组 0.448 4±0.0061) 0.568 8±0.0031)白藜芦醇+损伤组 0.208 9±0.0061) 0.156 2±0.0021)1 h 7 h对照组分组

图1 各组细胞形态(×3 000)

3 讨论

与疾病有关的危险因子，如高热量饮食、维生素缺乏(如叶酸和抗氧化剂)等，也与阿尔茨海默病、帕金森综合征等神经退行性疾病密切相关〔4〕。CR抗氧化应激损伤延缓衰老的可能机制之一是通过SIRT1介导的〔5〕。而白藜芦醇作为SIRT1的激动剂，用于模拟CR模型的体外研究也很多。SH-SY5Y细胞来源于神经母细胞瘤，其细胞形态及生理，生化功能与正常神经元相似，已经广泛用于神经生物学研究〔6〕。

本实验发现，白藜芦醇只对急性期的氧化应激损伤起保护作用，对于长期的氧化应激损伤，白藜芦醇显示一定的毒性反应。这一结论提示在CR或氧化逆境条件下，可能增加了细胞内的SIRT1蛋白的表达，通过抑制PPAR2r减少细胞的脂质过氧化的损伤〔7〕;调控 P53 的活性影响细胞的寿命〔8〕;调控FOXO的信号通路，启动细胞的抗氧化途径〔9，10〕。近年对白藜芦醇的研究显示，白藜芦醇在心脑血管疾病、内分泌疾病、肿瘤等方面都发挥了很好的作用，也有人把它作为CR的代用品，然而，目前对白藜芦醇在使用上也存在些问题，如:治疗剂量还很不一致，使用大剂量白藜芦醇显示一定的毒性反应〔10〕，与本实验中的观察结果一致，而且白藜芦醇吸收入血后的半衰期短，不便于临床的使用。因此，低糖处理更能模拟CR的体外模型。

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8 Mikael Molin，Yang JH，Sarah Hanzen，et al.Life span extension and H2O2resistance elicited by caloric restriction require the peroxiredoxin Tsa1 in Saccharomyces cerevisiae〔J〕.Mol Cell，2011;43(5):823-33.

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10 郭燕世.热量限制与白藜芦醇抗衰老的研究进展〔J〕.生理科学进展，2011;42(3):161-4.