VEGF、VEGF-R2在糖尿病动物视网膜中的表达研究

曹明芳 ，林 翔 ，程 良

（1.福建中医药大学附属人民医院眼科，福建福州 350004； 2.福建中医药大学附属人民医院骨伤科，福建福州 350004；3.福建中医药大学，福建福州 350122）

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGF-R2） 是糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）发生发展过程中的重要细胞因子和受体。本研究采用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射法建立了糖尿病（DR）动物模型，观察了VEGF、VEGF-R2在实验动物视网膜中的表达，现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 20只8w龄叙利亚金黄地鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；体重180g～200g。

1.1.2 试剂与仪器 2%STZ溶液：预先灭菌，使用前临时配制，配制后0.5h内注射完毕；血糖仪：德国拜耳公司快速血糖仪；显微镜：日本Olympus IX51；VEGF检测试剂盒：美国santa cruz biotechnology，inc；VEGF-R2检测试剂盒：英国abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 叙利亚金黄地鼠20只，随机分为正常对照组和模型组，每组10只。

模型组适应性喂养1w后，禁食12h，按50mg/kg的用量腹腔内注射2%STZ，连续3d；72h后取尾静脉血测血糖，第5天时重复检测血糖，确定糖尿病动物模型造模成功（血糖高于13.5mmol/L即算成功）。每2周测血糖、体重，视血糖维持状态决定是否进行2次造模。正常对照组适应性喂养1w后，予腹腔注射等体积柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，检测血糖、称重。2组均于造模16w后，处死动物取标本，每只动物均选取右眼，经4%多聚甲醛固定后行VEGF、VEGF-R2染色。

1.2.2 VEGF、VEGF-R2检测方法 标本取材后置于4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片。采用免疫组化SP法，按试剂盒说明书步骤进行，所有切片染色均采用相同条件，每批染色均设阳性对照、阴性对照。阳性对照用已知染色阳性的组织切片，阴性对照以PBS代替一抗孵育组织切片。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析，两组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF检测结果

VEGF主要位于视网膜内核层、神经节细胞层及Müller细胞。组织切片中显示淡黄色至棕黄色颗粒为阳性细胞标志。正常对照组基本没有VEGF阳性表达，模型组所有动物VEGF阳性表达明显多于正常对照组，视网膜外界膜、外核层、外丛状层、内核层、内丛状层及神经节细胞层均出现极强的棕色染色，染色的程度较正常对照组明显增强，面积明显增大。结果见表1和图1。

表1 2组视网膜VEGF染色结果比较 （±s）

表1 2组视网膜VEGF染色结果比较 （±s）

注：与正常对照组比较，1）P<0.01

组别 n 平均光密度 面积正常对照组 10 0.000±0.000 0.000±0.000模型组 10 33.511±11.4071） 192.251±46.3811）

图1 叙利亚金黄地鼠视网膜VEGF染色

2.2 VEGF-R2检测结果

VEGF-R2主要位于视网膜内核层、神经节细胞层及Müller细胞。组织切片中显示淡黄色至棕黄色颗粒为阳性细胞标志，正常对照组基本没有VEGFR2的阳性表达，模型组所有动物VEGF-R2阳性表达明显多于正常对照组，视网膜外界膜、外核层、外丛状层、内核层、内丛状层及神经节细胞层均出现极强的棕色染色，染色的程度较正常对照组明显增强，面积明显增大，结果见表2和图2。

表2 2组视网膜VEGF-R2染色结果比较 （±s）

表2 2组视网膜VEGF-R2染色结果比较 （±s）

注：与正常对照组比较，1）P<0.01

组别 n 平均光密度 面积正常对照组 10 0.000±0.000 0.000±0.000模型组 10 0.210±0.0281） 108.980±34.8941）

图2 叙利亚金黄地鼠视网膜VEGF-R2染色

3 讨 论

DR的发病机制与VEGF及其受体VEGF-R2密切相关。首先，VEGF是导致视网膜新生血管生成的主要原因，其次它还具有破坏血-视网膜屏障、增加血管渗漏的作用，第三，它还可增加内皮细胞对葡萄糖的转运，使细胞内的葡萄糖增加，导致血管并发症。在VEGF的3个受体中，VEGF-R2在DR的发病中起着重要作用。研究表明，在1w糖尿病鼠视网膜VEGF mRNA水平是正常对照组的3.2倍，视网膜血管通透性增加是正常对照组的1.8倍［1-3］。从本实验结果可知，正常叙利亚金黄地鼠视网膜免疫组化染色中VEGF和VEGF-R2基本无表达，表明正常大鼠视网膜VEGF和VEGF-R2含量极低；而模型组叙利亚金黄地鼠视网膜免疫组化染色中VEGF和VEGF-R2呈强表达，且阳性表达主要位于视网膜外界膜、外核层、外丛状层、内核层、内丛状层及神经节细胞层。这些改变均与人类糖尿病及糖尿病性视网膜病变的表现十分相似，故考虑该模型可作为研究人类糖尿病微血管并发症之DR发生、发展机制的重要途径。

［1］宋鄂，徐琪，王心蕊，等.血管内皮生长因子在糖尿病大鼠视网膜中的表达［J］.吉林大学学报：医学版，2003，29（1）：38.

［2］Frank R N，Amin R H，Eliott D，et al.Basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor are present in epiretinal and choroidal neovascular membranes［J］.Am J Ophthalmol，1996，122（3）：393.

［3］Gilbert R E，Vranes D，Berka J L，et al.Vascular endothelial growth factor and its receptors in control and diabetic rat eyes［J］.Lab Invest，1998，78（8）：1017-1027.