重楼皂苷对肝纤维化大鼠纤维化标志物的影响及其相关性分析

洪 燕 ，韩燕全 ，罗 欢 ，桂 洁 ，张 凯 ，姜 辉

（1.安徽中医药大学，安徽合肥230031；2.安徽中医药大学第一附属医院 国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥 230031）

我国约有1亿左右乙型病毒性肝炎（HBV）携带者，肝硬化的发病率逐年增高［1-2］。肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的必经之路，因此阻止肝纤维化的发展，对于肝硬化的防治至关重要。中医药对肝纤维化的治疗有较明显的优势，中药重楼临床应用于抗乙肝病毒合剂等多个治疗慢性乙型肝炎的方剂中，其保肝、抗病毒疗效确切［3］。课题组前期进行了重楼对化学性及免疫性肝损伤小鼠的实验研究，同时对重楼保肝作用的有效部位进行了筛选实验，结果表明重楼对急性肝损伤小鼠具有一定的保护作用，皂苷为其主要有效部位［4-6］。本文通过重楼皂苷干预CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠的实验，探讨其抗纤维化作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂 重楼皂苷为实验室自制，以薯蓣皂苷元为对照，按紫外分光光度法于408nm测定其含量为54.23%；参照《中华人民共和国药典》2010版对其有效成分进行测定，本品含重楼皂苷Ⅰ和Ⅱ总量为0.83%。复方鳖甲软肝片（内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司），秋水仙碱片（西双版纳药业有限责任公司）。丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、Ⅳ型胶原（CⅣ）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）及羟脯氨酸（HYP）试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，批号分别为：C009-2，C010-2，75024R，59624R，78025R，75263R，A030-2。

1.1.2 实验动物 普通级SD雄性大鼠，体重（200±20）g，购自安徽医科大学实验动物中心。

1.1.3 实验仪器 安捷伦8453-E型紫外分光光度计（安捷伦仪器有限公司），JW3021HR离心机（安徽嘉文），GL-88B漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司），DNP-9052BS-Ⅲ电热恒温箱（上海三发）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 SD大鼠适应性饲养3d后，随机分为7组，即：正常组、模型组、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组和重楼皂苷高、中、低剂量组，每组各10只。除正常组外，其他各组大鼠采用经典的CCl4致肝纤维化造模。具体方法为：按0.1mL/100g体重皮下注射 CCl4橄榄油溶液（CCl4∶橄榄油=5∶5），2次/w，共 12w，正常组皮下注射橄榄油［7-8］。

1.2.2 给药 第7周起，各组每天灌胃1次；正常组灌胃蒸馏水，其余各组灌胃相应药物，即秋水仙碱组剂量为0.1mg/kg，复方鳖甲软肝片组剂量为540mg/kg，重楼皂苷高、中、低剂量组剂量分别为300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg。

1.2.3 标本采集与处理 末次给药后，禁食8h，处死大鼠，取血，离心机分离血清，-20℃保存。称取肝组织300mg，-20℃保存。用ELISA法分别检测各指标。血清ALT、AST含量测定：检测方法按试剂盒说明书进行。血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ含量测定：检测方法按试剂盒说明书进行。肝组织HYP含量测定：组织解冻后，用生理盐水制成10%的肝组织匀浆，检测方法按试剂盒说明书进行。肝组织病理观察：取肝组织0.5g～1g，常规固定包埋，HE染色，普通光镜观察肝组织形态结构。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 重楼皂苷对肝纤维化大鼠血清ALT、AST和肝组织HYP含量的影响

与正常组比较，模型组血清ALT、AST含量，肝组织HYP含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，各治疗组血清ALT、AST含量，肝组织HYP含量降低，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

表1 重楼皂苷对肝纤维化大鼠ALT、AST、HYP的影响 （±s）

表1 重楼皂苷对肝纤维化大鼠ALT、AST、HYP的影响 （±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01

组别 n 剂量（mg/kg） ALT（U/L） AST（U/L） HYP（μg/L）正常组 10 - 50.06±7.26 41.99±10.95 220.28±41.87模型组 10 - 96.81±23.122） 89.87±18.222） 380.45±76.442）复方鳖甲软肝片组 10 540 70.29±13.892） 72.21±10.582） 238.25±68.202）秋水仙碱组 10 0.1 71.33±9.782） 64.30±15.872） 266.86±54.242）重楼皂苷高剂量组 10 300 72.14±7.122） 66.17±12.162） 261.03±55.812）重楼皂苷中剂量组 10 150 76.81±12.572） 75.51±4.611） 292.95±49.942）重楼皂苷低剂量组 10 75 79.25±9.351） 76.72±6.731） 314.17±46.571）

2.2 血清ALT、AST、肝组织HYP与肝纤四项相关性分析［9］

结果见表2。

表2 ALT、AST、HYP与肝纤四项相关性分析

相关性分析结果表明：ALT、AST、HYP与肝纤4项指标之间呈显著正相关（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 重楼皂苷对肝纤维化大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量的影响

与正常组比较，模型组血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量均降低，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。

2.4 重楼皂苷对肝纤维化大鼠肝组织病理的影响

正常组肝组织结构完整，肝小叶清晰，肝细胞排列规则；模型组局部肝细胞脂肪变性明显，形态不规则，排列杂乱，且有炎细胞浸润，组织间有大量纤维增生，有假小叶形成；复方鳖甲软肝片组肝纤维化程度有所减轻，仍能观察到脂肪样变性肝细胞；重楼皂苷高剂量组肝小叶可见，肝细胞结构基本正常，有少量炎细胞浸润和脂肪变性，纤维增生不明显，与秋水仙碱组病变相当；重楼皂苷中、小剂量组纤维增生，特别在小剂量组中可见纤维环绕，似假小叶存在，组织仍以肝细胞脂肪变性和炎细胞浸润为主要病变。结果见图1。

表3 重楼皂苷对肝纤维化大鼠肝纤四项的影响 （±s）

表3 重楼皂苷对肝纤维化大鼠肝纤四项的影响 （±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01

组别 n 剂量（mg/kg） HA（ng/L） LN（μg/L） CⅣ（μg/L） PCⅢ（μg/L）正常组 10 - 87.75±14.122） 96.82±15.832） 69.57±8.472） 68.31±6.992）模型组 10 - 180.35±14.82 226.54±41.28 115.35±17.07 97.73±13.59复方鳖甲软肝片组 10 540 96.83±9.832） 152.91±25.892） 77.09±19.012） 82.55±10.182）秋水仙碱组 10 0.1 97.22±11.682） 104.70±17.002） 80.51±26.522） 77.61±7.182）重楼皂苷高剂量组 10 300 123.28±11.452） 108.80±13.752） 86.42±21.242） 68.86±4.142）重楼皂苷中剂量组 10 150 124.50±17.722） 148.35±4.212） 93.68±21.441） 82.11±7.712）重楼皂苷低剂量组 10 75 117.99±37.952） 168.47±20.672） 114.83±14.08 85.26±14.791）

图1 重楼皂苷对肝纤维化大鼠肝组织病理的影响（HE×400）

3 讨论

重楼为百合科草本植物，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效［10］。现代研究表明其药理作用广泛，如抗肿瘤、抗病毒、止血、消炎等作用。目前对重楼的研究多关注其抗癌方面的作用，而对肝纤维化方面的研究笔者至今未见报道。

课题组前期进行了重楼保肝实验和有效部位筛选研究，表明重楼提取物有较明确的保肝作用，而重楼皂苷为其主要有效部位。故本实验分别以中药复方鳖甲软肝片和西药秋水仙碱作为阳性对照药，观察重楼皂苷对肝纤维化大鼠血清及肝组织相关纤维化标志物的影响，进一步探讨重楼对肝纤维化大鼠的保护作用，为其开发利用提供实验依据。

肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段，其病理基础主要是肝组织中大量的细胞外基质过度沉积，而细胞外基质主要来源于肝星状细胞（HSC），研究认为HSC的激活是肝纤维化发生的重要环节。激活的HSC分泌HA，释放至血窦中，因此血清中HA的含量可以直接反映HSC的活化程度，也间接反映了肝纤维化的进展。除了HA之外，LN、PCⅢ、CⅣ，也是反映细胞外基质沉积程度的血清标志物［11］，常合称四者为“肝纤四项”。这些血清标志物中，HA的特异性较高，其余并不是肝纤维化特有的，在肺纤维化、肾脏疾病中也可见异常升高。故本实验同时检测了血清ALT、AST的含量以及肝组织HYP的含量，并对指标间的相关性进行分析，以便对肝纤维化做出更加客观的诊断和评价。

ALT和AST是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”，主要存在于肝细胞中，当肝细胞变性坏死或细胞膜受到损害时，即可释放入血。1%的肝细胞受到损害，可使血液中ALT的浓度增加1倍。因此，血液ALT水平是反映肝脏是否受到损害的敏感指标，而AST升高的程度与肝细胞受损的程度相一致。本实验结果显示，重楼皂苷能显著降低肝纤维化大鼠血清中ALT及AST含量，提示其能减轻肝纤维化进程中的肝细胞损伤，对肝脏有一定保护作用。通过相关性分析发现，ALT、AST 与 HA、LN、CⅣ、PCⅢ之间在0.01水平上显著相关，随着转氨酶的降低，肝纤四项指标也随之降低。这一变化也与肝组织病理结果相一致，即光镜下观察HE切片，可见随着这些血清标志物的降低，肝纤维化程度有不同程度改善，重楼皂苷高剂量组改善程度与复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组相当，中、小剂量组改善程度不及复方鳖甲软肝片组和秋水仙碱组。

在肝纤维化的形成和发展中，以胶原蛋白为主要成分的胶原纤维大量增生，肝组织HYP主要存在于胶原蛋白中，其含量可反映肝纤维化的程度。实验结果显示重楼皂苷能明显降低肝纤维化大鼠肝组织中HYP水平，且与血清HA、LN、CⅣ、PCⅢ具有相关性。显然，同时检测上述指标，能更加客观地对肝纤维化做出诊断和评价。

以上结果表明，重楼皂苷能保护肝纤维化大鼠的肝功能，减轻肝纤维化程度；且随着肝功能的好转（转氨酶降低），肝纤维化指标也有所改善，其作用机制也在进一步研究中。

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