复脉汤对急性心肌缺血大鼠肌钙蛋白及心肌超微结构的影响

龚一萍，沈炜毅

（浙江中医药大学，浙江杭州 310053）

急性心肌缺血最常见的原因是由于冠状动脉粥样硬化导致冠状动脉管腔狭窄或闭塞，以及在狭窄的基础上发生冠状动脉痉挛而出现急性或慢性心肌供血不足［1］。现代研究证实，益气活血中药可以促进梗死区血管新生，抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡和心室重构，改善心功能［2-3］。在前期的临床验证中显示，自拟复脉汤能明显改善气虚血瘀型冠心病患者胸闷胸痛、气短乏力等症状，心电图ST-T改变有效率在90%以上。由于复脉汤抗心肌缺血的作用机制尚不清楚，故本研究拟观察复脉汤对实验性心肌缺血大鼠肌钙蛋白及心肌超微结构的影响，探讨其抗心肌缺血的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠（雄性）58只，生产许可证号：（2008001638685），体重 290g～300g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。饲养条件：饲养于浙江中医药大学实验动物中心，清洁饲养室保持恒温（20℃），相对湿度40%～60%。

1.1.2 实验药物 单味中药均由浙江中医药大学中医门诊部提供。复脉汤（主要由炙黄芪20g，生晒参10g，麦冬 12g，五味子 6g，丹参 15g，川芎 10g，红花10g，红景天10g，鸡血藤30g等组成）加水煎煮2次（第1次1.5h，第2次0.5h），制备成生药，浓度为3.75g/mL；炙甘草汤（炙甘草、生姜、桂枝、党参、生地黄、阿胶、麦冬、麻子仁、大枣）水煎浓缩至2g/mL，放入4℃冰箱；酒石酸美托洛尔（50mg/片，批号：H32025390）由阿斯利康制药有限公司提供。

1.1.3 试剂与仪器 3%戊巴比妥钠（美国Sigma，Sigma-P3761），大鼠肌钙蛋白I（cTnⅠ）ELISA检测试剂盒（杭州诚维生物科技有限公司，批号：E2014042103）。小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司ALc-V9），小动物多道生理记录仪（法国 ekma），离心机（AllegraX-15R），日立7020全自动生化分析仪（0500790S），冷冻高速离心机（Thermo），多功能酶标仪（Thermo），生化培养箱，莱卡UC7超薄切片机（0902332S），透射电子显微镜（日立H-7650）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 58只大鼠按随机数字表法分为7组，即复脉汤高、中、低剂量组，模型组、炙甘草汤组、酒石酸美托洛尔组（美托洛尔组）、假手术组。除模型组10只外，其余各组每组8只。假手术组及模型组给予等体积生理盐水；复脉汤高剂量组（37.5g/kg）、复脉汤中剂量组（18.75g/kg）、复脉汤低剂量组（9.375g/kg）、炙甘草汤组（20g/kg）、美托洛尔组（10mg/kg）每天给予相应药物灌胃1次，共计2w。

1.2.2 模型制备 除假手术组外参考文献［4］方法稍做改动制备模型。具体步骤为：以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈部与胸部皮肤去毛，常规消毒、铺巾。逐层分离皮肤、肌肉，暴露气管，开胸前气管插管，连接动物呼吸机行人工呼吸。四肢皮下连接心电图电极，记录Ⅱ导联心电图。在胸骨左侧3、4肋骨处切开皮肤，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，用开睑器撑开胸腔，剥离心包膜，暴露心脏，在左心耳与肺动脉圆锥间，左心耳下方约2mm，用0/6号缝合针，进针深度控制在0.1cm左右，结扎冠状动脉左前降支。结扎后迅速清除胸腔内多余血液，观察心电图变化，以心电图ST段立即抬高及结扎线以下心肌颜色苍白为造模成功。假手术组只穿线不结扎，其余步骤相同。

1.2.3 检测指标 实验结束后各组大鼠腹主动脉取血，3000r/min离心20min，分离血清，采用ELISA法检测血清中肌钙蛋白Ⅰ的浓度。在预先包被肌钙蛋白Ⅰ抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，温育并彻底洗涤。用底物3，3′，5，5′—四甲基联苯胺（Tetramethyi benzidine，TMB）显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。颜色的深浅和样品中的肌钙蛋白Ⅰ含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

1.2.4 心肌组织的电镜观察 取左前壁心尖上方5mm处心肌组织，立即投入预冷的2.5%戊二醛中固定，经PBS漂洗3次，四氧化锇固定后，用乙醇溶液（50%、70%、80%、90%、95%）梯度脱水，丙酮包埋渗透，加热聚合，超薄切片修块，用透射电镜在12000倍下观察各组心肌组织超微结构的变化。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 复脉汤对急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ浓度的影响

左前降支结扎成功率为100%，在手术中模型组死亡2只，炙甘草汤组死亡1只，余均存活至实验结束。各组大鼠血清cTnⅠ浓度检测结果，见表1。

表1 复脉汤对急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ浓度的影响 （±s）

表1 复脉汤对急性心肌梗死大鼠血清cTnⅠ浓度的影响 （±s）

注：与模型组比较，1）P<0.01；与炙甘草汤组比较，2）P<0.05，3）P<0.01

组别 n cTnⅠ（pg/mL）假手术组 8 322.68±15.431）模型组 8 511.51±29.81复脉汤高剂量组 8 426.76±37.371）3）复脉汤中剂量组 8 449.55±31.301）2）复脉汤低剂量组 8 460.43±37.651）炙甘草汤组 7 489.99±49.59美托洛尔组 8 430.52±30.811）3）

由表1可知，假手术组血清cTnⅠ浓度显著低于模型组（P<0.01）；与模型组比较，复脉汤各剂量组、美托洛尔组大鼠血清cTnⅠ浓度显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与炙甘草汤组比较，复脉汤中、高剂量组、美托洛尔组血清cTnⅠ浓度降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；复脉汤各剂量组与美托洛尔组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 对心肌缺血大鼠心肌超微结构的影响

各组大鼠心肌组织的电镜观察，结果见图1。模型组：心肌细胞Z线清晰可见，明暗带清楚可辨，肌原纤维断裂、扭曲、缩短，肌丝束间线粒体明显增多，排列紊乱，体积增大，嵴突破坏、断裂、溶解，空泡形成。假手术组：心肌细胞Z线尚规则，肌小节清晰，肌丝排列规则、整齐，线粒体在肌丝束排列成单排，线粒体嵴完整。复脉汤高剂量组：心肌细胞Z线清楚，肌原纤维基本规则，局部心肌纤维破坏溶解，线粒体基本完好，在肌丝束间多成单排，嵴突无破坏。复脉汤中剂量组：肌原纤维排列基本规则，局部心肌纤维有溶解渗出，较高剂量组明显，线粒体基本完好，嵴突无破坏，少量线粒体进入破坏溶解区。复脉汤低剂量组：心肌纤维排列基本整齐，Z线明显，线粒体形态不规则，部分心肌纤维断裂，扭曲变形。炙甘草汤组：Z线明显，明暗带清楚，心肌纤维排列欠规则，部分肌小节断裂，出现收缩带，闰盘结构轻度破坏，线粒体排列不规则，线粒体嵴突破坏、断裂、溶解，空泡形成。美托洛尔组：肌原纤维排列尚规则，少量纤维断裂溶解，局部渗出，线粒体结构基本正常。

图1 各组心肌组织电镜结果

3 讨论

当冠脉的供血与心肌的需血之间发生矛盾，冠脉血流量不能满足心肌代谢的需要时，就会引起心肌缺血缺氧。急剧的、暂时的缺血缺氧可引起心绞痛，而持续的、严重的心肌缺血可引起心肌坏死及心肌梗死。心肌梗死病死率较高，占心脏病死亡率的50%～70%。如何防治心肌缺血，有重大的临床意义。实验中观察的肌钙蛋白Ⅰ（Cardiac TroponInⅠ，cTnⅠ）仅存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上，调节肌肉的收缩与舒张。在心肌细胞缺血损伤的早期，即可引起血清cTnⅠ水平显著升高。观察cTnⅠ的变化，可以了解心肌缺血的损伤程度［5］。因此cTnⅠ可作为心肌缺血、损伤、坏死及急性冠脉综合征的敏感指标，心肌细胞缺血受损越严重，外周血清中肌钙蛋白Ⅰ含量越高。实验结果显示：复脉汤高、中、低剂量组cTnⅠ的浓度与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），说明复脉汤对急性心肌缺血的保护作用可能与降低外周血cTnⅠ的浓度有关，且复脉汤对心肌缺血的保护作用呈剂量依赖性。

本研究中复脉汤为临床自拟方，以益气活血化瘀立法，治以益气治本为主，活血通络治标为次，气行则血行，血行则无瘀，气血通畅，则心神得宁，故病霍然而愈。现代研究证实，益气活血中药具有良好的抗心肌缺血作用。李龙等［6］临床研究发现益气活血化瘀法能明显改善中医辨证属气虚血瘀型冠心病患者的心绞痛症状以及心电图缺血程度。手术结扎冠状动脉左前降支损伤心气，心气虚乏，无力推动血行，血脉瘀滞，故而出现气虚血瘀的状态。重用黄芪以助心气，并与生晒参相须为用，增强补益心气、推动血行的功效。结扎冠脉，血流受阻，加重血瘀的形成，丹参、红花活血养血，可扩张冠脉，改善冠心病血液流变学。川芎为血中之气药，鸡血藤活血养血通络，有助于血脉的通利，减轻心肌细胞的缺氧损伤。美托洛尔为β受体阻滞剂，能够减慢心率，降低心肌耗氧，减轻心肌缺血损伤，降低外周血cTnⅠ浓度。实验研究发现，复脉汤各剂量组与美托洛尔组之间血清cTnⅠ浓度比较差异无统计学意义。

心肌缺血同时还表现为心肌组织超微结构的损害，主要表现为肌原纤维结构排列紊乱、断裂、溶解、短缩以及线粒体结构破坏。正常的心肌细胞，肌原纤维是心肌细胞的最小单元体，线粒体结构破坏是细胞损害的最敏感指标。复脉汤各剂量组与美托洛尔组冠脉结扎所致的心肌超微结构损害明显减轻，肌原纤维排列基本有序，线粒体结构完整。

综上所述，复脉汤改善心肌缺血的机制可能与降低缺血心肌细胞cTnⅠ的释放、减轻心肌超微结构的损害有关。

［1］陈灏珠.实用内科学［M］.12版.北京：人民卫生出版社，2005：1237.

［2］衣慧.益气活血方影响心肌梗死后血管新生与成熟的HIF-1α信号机制研究［D］.西安：第四军医大学，2013.

［3］章燕，戴小华.益气活血中药改善急性心肌梗死后左心室重构实验研究进展［J］.安徽中医学院学报，2012，31（2）：74-76.

［4］周文武，刘玲，陈军，等.冠状结扎法制作大鼠心肌缺血模型［J］.中国实验动物学，2004，12（4）：226-230.

［5］武建国，顾可梁，童明庆，等.医学实验诊断学进展［M］.南京：东南大学出版社，2000：228-229.

［6］李龙，李红彦，遇昕，等.益气活血化瘀法治疗冠心病心绞痛30例［J］.中国中医药现代远程教育，2010，8（2）：22-23.