兔血清对氧磷酶在防治有机磷中毒中的作用

赵维，崔玥

(沈阳医学院附属中心医院急诊科，辽宁 沈阳 110024)

据报道，我国每年农药中毒人数年平均超过20 万，其中有机磷中毒超过80%，死亡率高达15%。有机磷的毒性在于它能作用于体内的胆碱酯酶，使其磷酰化而失去活性而导致中毒［1］。

对氧磷酶(paraoxonase，PON)是1953年被发现的一种能水解神经毒杀虫剂对氧磷的酯酶。而且PON 对于多种有机磷杀虫剂如对氧磷、敌敌畏以及神经毒剂沙林、索曼均具有明确的降解作用［2－3］。

深入研究发现，在众多哺乳动物中兔血清的PON 活性最高［4－5］，本实验拟在对大鼠进行有机磷农药染毒前，通过静脉预防性注射兔血清PON，比较其同传统的解毒剂(阿托品+氯解磷定)的解毒效果，以期寻找到防治有机磷中毒的更有效、更安全的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取Wistar 大鼠60 只，体重200～250 g，雌雄各半。新西兰白兔20 只，雌雄各半。均由本院实验动物中心提供。控制室温(18±1)℃，湿度(50±10)%。自由饮水和摄食，无闪烁光控条件下饲养。适应动物房环境1 周后用于实验。

1.2 材料 80%敌敌畏乳油剂由河南海普农药厂生产，实验前将敌敌畏用生理盐水配制成10 mg/ml 的乳浊液。采用液相色谱技术通过亲和层析和离子交换层析法制备兔血清PON［6］。实验前，用50 mmol/L (pH 8.15)的HEPES 缓冲液将制备的兔血清PON 稀释至10 U/ml。阿托品和氯解磷定(PAM-CL)均购自上海旭东制药公司，分别用生理盐水稀释成10 mg/ml 和30 mg/ml 的溶液。胆碱酯酶(AchE)检测试剂盒购于南京建成生物试剂公司。

1.3 方法 按照雌雄各半的原则，采用双盲法，将所有大鼠随机分成对照组(A 组)、阳性对照组(B组)和治疗组(C 组)。C 组按照注射的兔血清PON剂量分成低、中、高(C1、C2、C3)3个亚组。每组10 只大鼠。各组大鼠均按照50 mg/kg 体重经口灌胃给予敌敌畏。B 组于染毒前30、15 min 分别给予阿托品(10 mg/kg)、氯解磷定(30 mg/kg)腹腔注射。C 各亚组于染毒前10 min 按照5 U/kg、10 U/kg、15 U/kg 给予兔血清PON 尾静脉注射。A 组给予等量的生理盐水腹腔注射。

1.3.1 观察和记录指标 仔细观察记录各组大鼠的中毒症状(包括M 样症状:流涎流涕、尿便失禁;N 样症状:肌纤维颤动、肌无力;CNS 症状:烦躁不安、共济失调、昏迷)以及平均的出现时间，计算24 h 死亡率。肌束震颤评分参考Bleeckler 标准进行［7］。0 分:无肌束震颤;1 分:口周肌肉出现震颤，其他肌肉偶见震颤;2 分:腹肌、后肢肌多处出现震颤;3 分:腹肌、后肢肌频繁出现多发性震颤。

1.3.2 检测指标 各组分别于染毒前1 h 和染毒后10 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h 于尾尖采血。测定不同时间点全血、红细胞的AchE 水平。计算24 h 血及红细胞的AchE 恢复率。

2 结果

2.1 各组大鼠中毒症状和24 h 死亡率情况 同A组比较，B、C 组大鼠中毒症状明显减轻，24 h 死亡率降低，见表1。

表1 治疗性给予PON 对急性敌敌畏中毒大鼠症状和24 h 死亡率的影响

2.2 PON 对于急性敌敌畏中毒大鼠血AchE 的影响 A 组血AchE 的活性在中毒后的短期即下降非常明显。染毒后30 min 即降到了正常值的40%，而后持续下降，直至2 h 左右死亡。死亡点血液检测的结果，AchE 的活性为(1 235.1 ±33.5)U/L。相对于A 组，治疗各组的血AchE 的下降速度要缓慢，下降程度轻。B 组中，有机磷对血AchE的抑制程度要弱于A 组，血AchE 于染毒后6 h 开始出现回升。而24 h，血AchE 的恢复率也只有正常值的60%。C 组各亚组中，有机磷对血AchE 的抑制程度明显轻于A 组，其中C1 组的血AchE 最低只降至正常值的50%。C 组各亚组的血AchE 活性回复时间均早于B 组，平均于染毒后2 h 血AchE 的活性开始回升，并且恢复速度快。其中C3组，染毒后24 h 血AchE 恢复率接近正常水平90%，见表2。

表2 预防性给药对于急性敌敌畏中毒大鼠血AchE 的影响(U/L，)

表2 预防性给药对于急性敌敌畏中毒大鼠血AchE 的影响(U/L，)

从血AchE 变化曲线中可以清楚的看出，C 组(治疗组)各亚组在不同时间点血AchE 的活性均显著高于A 组(对照组)和B (阳性对照组)，提示PON 治疗各组的疗效优于阿托品和氯解磷定联用。血AchE 的恢复情况同PON 施加的剂量呈正相关。即随着PON 给药量的增加血AchE 的恢复越好，见图1。

图1 预防性给药对血清AchE 的影响

2.3 PON 对于急性敌敌畏中毒大鼠红细胞AchE的影响 各组红细胞中的AchE 在染毒后均出现了不同程度的下降:从图1、2 中可以看出有机磷对于红细胞中的AchE 的抑制程度要强于对血中AchE 的抑制，这一点在各组的AchE 的24 h 恢复率上显示得很清楚。在中毒的早期，有机磷对红细胞中的AcHE 比对血中的AchE 抑制轻。但是随时间推移，红细胞中AchE 活性受到了明显的抑制，抑制程度要强于对血AchE 的抑制。并且有机磷对红细胞中AchE 抑制的持续时间长、恢复慢。实验结束时，红细胞中的AchE 恢复程度远低于血中AchE 的恢复程度，见表3。

C 组各亚组在各时间点红细胞AchE 的活性均显著高于A、B 组，PON 对于红细胞的保护作用明显优于传统疗法(阿托品和氯解磷定联用)。红细胞AchE 的恢复情况同PON 施加的剂量呈正相关，见图2。

表3 预防性给药对于急性敌敌畏中毒大鼠红细胞AchE 的影响(U/L，)

表3 预防性给药对于急性敌敌畏中毒大鼠红细胞AchE 的影响(U/L，)

注:P ＜0.05

图2 预防性给药对红细胞AchE 的影响

3 讨论

很多研究发现PON 在神经毒剂(索曼、塔崩)急性中毒时能降低死亡率，延长存活时间，并对中枢神经系统有保护作用［8］。PON 对索曼中毒小鼠的作用研究发现，PON 对索曼致死效应的保护率大约是对照组的212 倍［9］。用PON 作预防性治疗，以1.3 倍LD50剂量的索曼注射染毒恒河猴，动物仅表现出较轻微的毒性反应，未出现死亡［10］。Petrikovics等［11］给予对氧磷染毒后的小鼠一定量的PON，可以显著提高毒素的LD50，若与阿托品和氯解磷定联合使用，可对染毒小鼠产生近千倍的保护作用。这些都进一步证实了PON 可以用作外源性解毒剂预防和治疗有机磷中毒的可能性。

本实验结果提示，及时使用解毒酶PON，可对染毒的大鼠提供140 倍以上的保护。该酶在染毒前使用，可获得极好的对有机磷中毒的预防作用［12］，可用于亚致死剂量染毒大鼠，可减轻有机磷对体内胆碱酯酶和羧酯酶的抑制［9－10］。本研究观察到的PON 对敌敌畏急性中毒的预防效果，表现为推迟震颤出现时间及减轻震颤强度、延长动物存活时间，其结果与文献报道［4，9］基本一致。明显优于传统疗法中的阿托品的效果，显著降低了死亡率。

PON 不仅可以预防中毒，有文献报道PON 在体外也具有一定的解毒作用［13］。由于其PON 能直接裂解、破坏有机磷分子。该机制可进一步被利用在生态环境保护、废物处理以及去除蔬菜、水中有机磷污染等方面。PON 的底物范围广，解毒用量少但活力高，若能够通过基因重组的方式大量生产［11，14］，将为有机磷农药中毒的防治提供一种全新的安全有效的方法。

［1］Knaak JB，Dary CC，Power F，et al.Physicochemical and biological data for the development of predictive organophosphorus pesticide QSARs and PBPK/PD models for human risk assessment［J］.Crit Rev Toxicol，2004，34 (2):143－207.

［2］滕霞，孙曼霁.对氧磷酶研究进展［J］.生命科学，2002，14 (2):107－111.

［3］杨玉恒，马桂芬，薛永蕙.对氧磷酶－1 与有机磷农药中毒的关系［J］.河北医药，2005，27 (11):856－857

［4］Costa LG，Manzo L.Biochemical markers of neurotoxicity:research strategies and epidemiological applications ［J］.Toxicol Lett，1995，77 (1－3):137－144.

［5］Rochu D，Chabriere E，Masson P.Human paraoxonase:a promising approach for pre-treatment and therapy of organophosphorus poisoning［J］.Toxicology，2007，233 (1－3):47－59.

［6］Furlong CE，Richter RJ，Chapline C，et al.Purification of rabbit and human serum paraoxonase ［J］.Biochemistry，1991，30(42):10133－10140.

［7］Worek F，Eyer P，Kiderlen D，et al.Effect of human plasma on the reactivation of sarin-inhibited human erythrocyte acetylcholinesterase ［J］.Ach Toxicol，2000，74 (1):21－26.

［8］Sogorb MA，Vilanova E，Carrera V.Future applications of phosphotriesterases in the prophylaxis and treatment of organophosporus insecticide and nerve agent poisonings［J］.Toxicol Lett，2004，151 (1):219－233.

［9］Tuovinen k1.Protection of organophosphate-inactivated esterases with phosphotriesterase ［J］.Fundam App Toxical，1996，31:2101.

［10］Petrikovics I.Antagonism of paraoxon intoxication by recombinant phosphotriesterase encapsulated within sterically stabilized liposomes ［J］，Toxicol App Pharmacol，1999，156:561.

［11］Petrikovics I，Papahadjopoulos D，Hong K，et al.Comparing therapeutic and prophylactic protection against the lethal effect of paraoxon［J］.Toxicol Sci，2004，77 (2):258－262.

［12］Pei L.Antagonism of the lethal effects of paraoxon by carrier erythrocytes containing phosphotriesterase ［J］.Fundam App Toxico，1995，28:2091.

［13］刘胜军，叶建锋.重组有机磷水解酶的研究进展［J］.国外医学卫生学分册，2003，30 (3):151－155.

［14］Mee-Hie Cho C，Mulchandani A，Chen W.Altering the substrate specificity of organophosphorus hydrolase for enhanced hydrolysis of chlorpyrifos［J］.App and Environ Microb，2004，70(8):4681－4685.