HPV感染、HIF-1α及VEGF蛋白表达与非小细胞肺癌相关

周 颖，张 辉，谢永红，李晓超，沈 彦，尹端端

(秦皇岛市第一医院 1.病理科；2.科教科；3.肿瘤科， 河北 秦皇岛 066000)

研究论文

HPV感染、HIF-1α及VEGF蛋白表达与非小细胞肺癌相关

周 颖1*，张 辉1，谢永红2，李晓超1，沈 彦1，尹端端3

(秦皇岛市第一医院 1.病理科；2.科教科；3.肿瘤科， 河北 秦皇岛 066000)

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)感染在非小细胞肺癌(NSCLC)发生中的病因学意义，并初步分析HPV感染与低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达之间的关系。方法用免疫组化法检测60例NSCLC及20例肺良性病变组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达，用PCR法选用HPV16、18型特异性引物检测两组中HPV DNA的表达。结果1)NSCLC组HPV DNA积分吸光度比值为0.6046±0.0224，显著高于肺良性病变组的0.0275±0.1230(P<0.05)。2)NSCLC组HIF-1α和VEGF蛋白的平均吸光度值分别为0.2548±0.0219和0.2051±0.0321，均显著高于肺良性病变组(0.0826±0.0150和0.0726±0.0227)(P<0.05)。3)NSCLC中HIF-1α的表达率与VEGF呈正相关(P<0.05)。4) NSCLC中HPV(+)组VEGF的表达率为56.0%，显著高于HPV(-)组的28.6%(P<0.05)。结论HPV感染可能是NSCLC发生的病因学因素之一；HPV感染可能通过上调VEGF的表达，促进肺癌的发生发展。

非小细胞肺癌；人乳头状瘤病毒；低氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种DNA病毒，感染人和动物的皮肤或黏膜可引起增殖性损伤。近年来，越来越多的国内外临床和实验室研究检测出肺癌患者携带HPV[1- 2]，尤其是HPV 16和18型。但HPV感染与肺癌的关系，目前说法不一。低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是近年发现的一种转录因子，已有研究发现HIF-1α在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中过度表达。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管形成的中心调控因子，与肿瘤的生长、侵袭、转移密切相关。然而肺癌中HIF-1α、VEGF与HPV感染的关系尚未见报道。本研究通过检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)中HPV DNA、HIF-1α和VEGF蛋白的表达情况，探讨HPV感染在NSCLC发生中的病因学意义，并初步分析NSCLC中HPV感染与HIF-1α、VEGF蛋白表达的关系。

1 材料与方法

1.1 标本与试剂

收集秦皇岛市第一医院2012- 01—05 SCLC新鲜标本60例， 全部患者均已知情同意，其中男46例，女14例；年龄36～80岁；鳞癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴结转移30例，无淋巴结转移30例；吸烟者43例，不吸烟者17例。20例肺良性病变组织，其中包括肺结核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大疱4例，支气管扩张1例。标本取材后，部分置-20 ℃保存，部分中性甲醛固定，石蜡包埋。

PCR引物均由北京奥科生物公司合成。免疫组化HIF-1α抗体和VEGF抗体及通用型SP试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。

1.2 HPV PCR检测

1.2.1 引物：选用分别用来扩增HPV16、18型的特异性引物2对及内参GAPDH。引物序列如表1。

1.2.2 组织DNA的提取：取适量冻存组织，加提取缓冲液制成单细胞悬液后，沸水浴10 min，冷却至室温加蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇反复抽提3次，再经100%冰冷无水乙醇沉淀、70%冰冷无水乙醇洗涤后，加TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)缓冲液溶解所得DNA，4 ℃保存。

表1 引物序列和产物长度

1.2.3 PCR扩增反应：PCR反应体系：每25 μL反应体系中包含 10×缓冲液 2.5 μL，20 pmol/μL引物各0.5 μL，Taq酶1 μL(1 U/μL)，Mg2+1.5 μL，dNTPs 0.5 μL，去离子水16.5 μL及DNA模板2 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min，循环特征为94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环，72 ℃延伸8 min。每次实验以不加模板为阴性对照，HPV16、18型分别用Siha和HeLa细胞系DNA作阳性对照。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，于紫外透射仪上观察结果，继用SQ9636 型扫描系统扫描。HPIAS-1000型图像分析系统检测各组目的基因及内参的积分吸光度值(A),并以两者比值作为各组HPV DNA的相对表达量。

1.3 免疫组化检测HIF-1α和VEGF

1.3.1 方法：免疫组化染色步骤严格按试剂盒说明书操作。一抗稀释浓度为1/100。阴性对照用PBS代替一抗。

1.3.2 判断标准：HIF-1α阳性表达为细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒，VEGF阳性表达为胞质出现棕黄或棕褐色颗粒，显色结果由两位病理医生采用半定量评分系统独立判定。每例均高倍镜下(×400)随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，取平均值，用半定量积分法判断结果：0分阴性；1分<25%；2分25%～75%；3分>75%。阳性强度：1分弱表达(浅黄色)；2分中等强度表达(棕黄色)；3分强表达(棕褐色)。两者积分相乘，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(±)，4～6分为中等阳性(+)，7～9分为强阳性(++)。就其结果进行分析，将-、±合并为“-”，+、++合并为“+”，以简化数据处理。同时用HPIAS-1000高清晰度图像处理系统,分析各组切片的免疫组化结果，用棕黄或棕褐色阳性颗粒的平均吸光度值(A)表示其HIF-1α、VEGF蛋白表达量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1HPVDNA的PCR检测结果及与临床病理特征的关系

M.marker；1,2.HPV16 positive,negative control；3,4.HPV16；5,6.HPV18 positive、negative control；7,8.HPV18图1 PCR检测HPV16、HPV18型DNA扩增结果电泳图Fig 1 Electrophoresis of HPV16/18 DNA detected by PCR

NSCLC组HPV DNA积分吸光度比值为0.6046±0.0224，显著高于肺良性病变组的0.0275±0.1230(P<0.05)(图1)；NSCLC组HPV感染与性别、年龄、吸烟、组织学分型无关，而与组织分化程度及淋巴结转移相关。高分化型 HPV DNA积分吸光度比值显著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴结转移组HPV DNA积分吸光度比值显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)(表2)。

表2 NSCLC中HPV感染与临床病理特征的关系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

图2 NSCLC中HIF-1α的阳性表达Fig 2 Positive expression of HIF-1α in NSCLC(×400)

2.2 HIF-1α、VEGF的检测结果及两者的相关性

NSCLC中HIF-1α的阳性表达位于细胞核(图2)，平均吸光度值为0.2548±0.0219，显著高于肺良性病变组的0.0826±0.0150(P<0.05)。VEGF的阳性表达位于胞质(图3)，平均吸光度值为0.2051±0.0321，显著高于肺良性病变组的0.0726±0.0227(P<0.05)。NSCLC中HIF-1α(+)组VEGF的表达率为65.5%(19/29例)，明显高于HIF-1α(-)组的16.1%(5/31例)，经统计学分析，两者呈正相关(r=0.504,P<0.05)(表3)。

图3 NSCLC中VEGF的阳性表达Fig 3 Positive expression of VEGF in NSCLC(×400)

HIF⁃1αnVEGFpositivenegativepositive2919(655%)10(345%)negative315(161%)∗26(839%)∗

*P<0.05 compared with positive group.

2.3NSCLC中HIF-1α、VEGF蛋白表达与临床病理特征的关系

HIF-1α表达与性别、年龄、吸烟和组织学分型无关，与组织分化程度及淋巴结转移相关。高分化型HIF-1α蛋白平均吸光度值显著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴结转移组HIF-1α蛋白平均吸光度值显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)(表4)。VEGF表达与性别、年龄、吸烟和组织学分型无关，与组织分化程度及淋巴结转移相关。高分化型VEGF蛋白平均吸光度值显著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴结转移组VEGF蛋白平均吸光度值显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)(表5)。

2.4NSCLC中HPV感染与HIF-1α、VEGF表达的关系

NSCLC中HPV(+)组VEGF的表达率为56.0%(14/25例)，显著高于HPV(-)组的28.6%(10/35例)(P<0.05)。 HPV(+)组与HPV(-)组间HIF-1α的阳性表达率分别为52.0%(13/25例)和45.7%(16/35例)，差异无统计学意义(表6)。HPV(+)、HIF-1α(+)组VEGF的表达率为69.2%(9/13例)，HPV(+)、HIF-1α(-)组VEGF的表达率为41.7% (5/12例)，两组间无显著性差异(χ2=1.924,P>0.05)。

表4 NSCLC中HIF-1α表达与临床病理特征的关系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

表5 NSCLC中VEGF表达与临床病理特征的关系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

表6 NSCLC中HPV感染与HIF-1α、VEGF表达的关系

*P<0.05 compared with positive group.

3 讨论

HPV感染是宫颈癌的主要病因，然而近年来HPV感染与肺癌的关系已经引起人们的重视[3]。本研究证实，NSCLC组HPV DNA表达显著高于肺良性病变组，提示HPV感染与NSCLC的发生有关，HPV感染可能是NSCLC发生的病因学因素之一。

HIF-1是由α、β亚单位构成的异二聚体，其中HIF-1α受缺氧的调节。缺氧是实体肿瘤微环境特征之一。细胞缺氧时，细胞核中HIF-1α显著增加。HIF-1α不仅调节众多的下游基因以维持或促进肿瘤的血管形成和肿瘤的发展，而且可反馈接受肿瘤生长过程中产生的因子或缺氧环境上调表达，如此形成恶性循环促进肿瘤生长、侵袭和转移[4- 6]。本研究中， NSCLC组HIF-1α蛋白表达显著高于肺良性病变组，提示HIF-1α与NSCLC的发生发展相关。

VEGF是目前已知的作用最强的促血管生成因子，能刺激肿瘤新生血管内皮细胞增殖，促进微小静脉通透性的增加，诱导血管形成。丰富的肿瘤新生血管必然会加速实体瘤的生长、侵袭及转移。近年来，肺癌中VEGF表达的研究报道较多，这些研究表明，VEGF在肺癌中高表达，其在肺癌中的表达与肺癌恶性程度、易发生淋巴结转移及预后不良有关[7]。本研究中， NSCLC组VEGF蛋白表达显著高于肺良性病变组，提示VEGF参与了NSCLC的发生发展过程。VEGF是HIF-1α最重要的靶基因之一。组织缺氧时，HIF-1α不仅可以促进VEGF转录，还能增加VEGFmRNA稳定性，从而上调VEGF表达[8]。大量文献报道，VEGF和HIF-1α在许多肿瘤中被检出，并发现HIF-1α升高的同时VEGF表达也上升。本研究显示NSCLC中HIF-1α(+)组VEGF的表达率显著高于HIF-1α(-)组，两者呈正相关。

本研究发现NSCLC中，HPV(+)组VEGF的表达率显著高于HPV(-)组，提示NSCLC中HPV感染可能上调VEGF表达。HPV(+)组与HPV(-)组间HIF-1α的阳性表达率差异无统计学意义，提示NSCLC中HIF-1α与HPV感染无相关性。本研究还显示，NSCLC中HPV(+)、HIF-1α(+)组VEGF的表达率与HPV(+)、HIF-1α(-)组VEGF的表达率无显著性差异。提示HPV感染的NSCLC中，其HIF-1α与VEGF的表达不存在相关性。说明NSCLC中HPV感染上调VEGF表达的这种作用不是通过HIF-1α来调节的，推测可能直接通过HPV16、18 E6蛋白发挥作用，HPV E6可能如一些原癌基因一样能够上调VEGF启动子的活性[9]，促使VEGF表达增强，促进NSCLC发生发展。其具体机制有待进一步在体外细胞培养体系中进行验证和分析。

NSCLC组中，HPV感染、VEGF表达均与性别、年龄、吸烟、组织学分型无关，而与组织分化程度相关。可能是由于分化成熟的细胞退出了细胞周期，细胞不再具有分裂能力，细胞内仅有少量病毒复制所需的复制酶。因此，高分化型HPV DNA表达低于中和低分化型，其上调VEGF的作用减弱，使VEGF蛋白的表达也低于中和低分化型。同时发现HPV感染和VEGF表达均与淋巴结转移有关。推测HPV感染上调VEGF表达，而VEGF是肿瘤发生转移的一个重要指标，不仅诱导血管生成，还可诱导肿瘤外周形成新的淋巴管，促进癌细胞通过淋巴管转移到淋巴结。提示HPV感染和VEGF表达在淋巴结转移中可能起着协同作用。

综上所述，HPV感染可能是NSCLC发生的病因学因素之一；HPV感染可能通过上调VEGF的表达，促进肺癌发生发展，并参与其浸润、转移。 因此选用HPV疫苗预防高危HPV感染及针对VEGF的抗血管治疗将为NSCLC的预防和治疗开辟新的途径。

[1] Syrjanen KJ. HPV infection and lung cancer [J]. J Clin Pathol, 2002, 5: 885- 891.

[2] Wang Y, Wang A, Jiang R,etal. Human papillomavirus type 16 and 18 infection is associated with lung cancer patients from the central part of China [J]. Oncol Res, 2008, 20: 333- 339.

[3] Zafer E, Ergun M, Alver G,etal. Detection and typing of human papillomavirus in non-small cell cancer[J]. Respiration, 2004, 71: 88- 90.

[4] 江丽丽, 张建斌, 谢平, 等. LPS预处理增加CoCl2诱导小鼠巨噬细胞表达HIF-1α[J]. 基础医学与临床, 2013, 33: 1297- 1301.

[5] 李能莲, 李光明, 骆亚莉, 等.HIF-1α和HIF-2α在胃癌中的表达及意义[J]. 基础医学与临床, 2010, 30: 619- 622.

[6]王路乔, 黄波, 黄茶花, 等. 自噬抑制剂促进缺氧诱导的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡[J]. 基础医学与临床, 2014, 34: 185- 189.

[7] 杨东霞, 项锋钢. 肺癌患者血管内皮生长因子表达与缺氧及肿瘤生物学行为和预后的关系[J]. 中国临床康复, 2005, 9: 115- 118.

[8] 杨清平, 周知, 吕波, 等. 小剂量VCR联合Endostar抑制PLA-802细胞系VEGF表达[J]基础医学与临床, 2011, 31: 32- 36.

[9] Lopez-ocejo O, Viloria-petit A, Bequet-romero M,etal. Oncogenes and tumor angiogenesis:the HPV-16 E6 oncoprotein activates the vascular endothelial growth factor(VEGF) gene promoter in a p53 independent manner[J]. Oncogene, 2000, 19: 4611- 4620.

Infection of HPV and its relationship withthe expression of HIF-1α and VEGF protein in non-small cell lung cancer

ZHOU Ying1*, ZHANG Hui1, XIE Yong-hong2, LI Xiao-chao1, SHEN Yan1, YIN Duan-duan3

(1.Dept. of Pathology; 2.Dept. of Science and Education;3.Dept. of Oncology, the First Hospital of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066000, China)

ObjectiveTo investigate the etiological role of human papillomavirus(HPV) infection in the carcinogenesis of non-small cell lung cancer(NSCLC) and to discuss the possible relationship between HPV infection and HIF-1α,VEGF expression.MethodsBy using immunohistochemistry, the expressions of HIF-1α and VEGF protein were detected in 60 cases of NSCLC tissues and 20 cases of lung benign diseases tissues. PCR was employed to detect the expression of HPV16/18 DNA.Results1)The HPV DNA expression was 0.6046±0.0224 in NSCLC group which significantly higher than 0.0275±0.1230 in the benign diseases group (P<0.05). 2)The HIF-1α protein and VEGF protein expressions were 0.2548±0.0219 and 0.2051±0.0321 respectively in NSCLC, significantly higher than that in the benign diseases group (0.0826±0.0150 and 0.0726±0.0227) (P<0.05). 3)The expression rate of HIF-1α was significantly correlated with VEGF in NSCLC(P<0.05).4)The positive expression rate of VEGF was significantly higher in HPV DNA positive group (56.0%) than that in HPV DNA negative group(28.6%,P<0.05) in NSCLC.ConclusionsHPV infection may be one of the etiological factors in the carcinogenesis of NSCLC. HPV infection increases VEGF expression, promotes the occurrence and development of NSCLC.

non-small cell lung cancer; human papillomavirus; hypoxia inducible factor-1α; vascular endothelial growth factor

2014- 01- 09

2014- 03- 24

秦皇岛市科技支撑计划(2012023A135)

*通信作者(correspondingauthor)：zhouying8042254@sina.com

1001-6325(2014)08-1065-06

R 734.2

A

新闻点击

听力受损与老年人智力衰退有关

据美国WebMD医学新闻网2013-02-04报道，听力受损和智力衰退是两种常见的老化症状，现有研究发现，两者之间可能有关联。

70岁以上的老年人中，约有2/3有一定程度的听力受损。在未来20年，患老年痴呆症的人数预计将增加1倍，所以研究人员希望了解助听器是否可以减缓老年人智力衰退。

领导这项研究的耳科医生、流行病学家Frank R. Lin博士认为，在研究过程中，听力衰退的年长者比听力正常者更容易有记忆和思考问题。平均来说，有听力问题的参与者智力明显受损的时间，比那些没有听力问题的人提前3年。

这项针对近2 000名参加老化与健康研究的70～80岁年长者，在第5年做了听力测试，并在接下来6年里进行了一系列的测试，评估记忆和思考能力的衰退情况。结果显示，听力受损的男、女衰退速度比听力正常者快30%～40%；听力受损的程度越大，心智功能衰退幅度越大。

虽然研究并未提出与老化有关的听力受损是如何恶化记忆或思考问题，但Lin博士认为，有几种说法：一种理论是未治疗听力受损的人，常与社会隔离，导致智力下降。之前的研究已鉴定出，孤独是这些能力衰退的风险因子。另一个理论是，工作记忆受限于它可以容纳和操作的信息量。内耳的工作是接收声音，并在传到大脑译码之前准确的编码，但这对于有听力受损的人很难。如果大脑必须不断消耗更多的资源来解码声音，可能为认知付出更多。

研究结果发表在美国医学协会(JAMA)内科期刊(JAMA Internal Medicine)网络版。