心肌细胞自噬对心力衰竭大鼠心功能的影响

王陵军，高梦夕， 陈 洁， 孙敬和

(广州中医药大学 第一附属医院 国家重点学科中医内科学实验室, 广东 广州 510405)

研究论文

心肌细胞自噬对心力衰竭大鼠心功能的影响

王陵军*，高梦夕， 陈 洁， 孙敬和

(广州中医药大学 第一附属医院 国家重点学科中医内科学实验室, 广东 广州 510405)

目的观察心力衰竭时自噬相关蛋白的表达以及抑制自噬对心力衰竭的影响，探讨自噬在心力衰竭发病过程中的作用。方法实验分为对照组(control)、心力衰竭组(HF)和3甲基腺嘌呤(3MA)组。心力衰竭组采用腹主动脉缩窄术制备大鼠心力衰竭动物模型。3MA组给予心力衰竭大鼠自噬特异性抑制剂3MA 15 mg/kg，连续两周。采用心导管术检测大鼠左室舒张末压(LVEDP)、左室等容收缩期压力上升最大速率+dp/dtmax、左室等容舒张期压力下降的最大速率-dp/dtmax。用Western blot法检测心肌组织自噬相关蛋白beclin-1、cathepsin D的表达。结果1)心力衰竭组LVEDP较对照组显著增加(P<0.05)，±dp/dtmax较对照组显著降低(P<0.05)。使用3MA组LVEDP较心力衰竭组显著降低(P<0.01)，±dp/dtmax较心力衰竭组显著增加(P<0.01，P<0.05)。2)心力衰竭组心肌组织自噬相关蛋白beclin-1和cathepsin D表达较对照组显著增加(P<0.05)，而3MA组beclin-1、cathepsin D的表达较心力衰竭组显著减少(P<0.05)。结论心肌细胞自噬在心力衰竭发病过程中发挥着致病作用。

自噬；心力衰竭；3甲基腺嘌呤； beclin-1; cathepsin D

心力衰竭在最近十几年间发病率稳步增加。最新数据显示，在美国20岁以上大约有510万人患有心力衰竭，每年有超过27万人死于心力衰竭，预计到2030年，心力衰竭患者人数将增加25%[1]。在中国，成年人心力衰竭的患病率为0.9%，目前35～74岁成年人有420万心力衰竭患者[2]，随着中国人口的快速老龄化，心力衰竭的患病率还会显著上升。心力衰竭将要成为中国心血管病领域的重要公共卫生问题，严重地消耗着宝贵的卫生资源。自噬是一个高度保守的由溶酶体介导的细胞内蛋白质和细胞器再循环的细胞机制。一直以来自噬被认为是细胞的自我保护机制，是可以调节的，但近年的研究发现，不受控制的自噬活动被认为是包括神经变性功能紊乱[3]、癌症[4]、感染性疾病[5]等疾病的发病机制，是调节失灵的表现。本研究旨在探索自噬在压力负荷过重导致的心力衰竭发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 级SD 雄性大鼠30只，体质量270 ～ 300 g(广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号0094274)。自噬相关蛋白beclin-1抗体(sc-10086)、cathepsin D(sc-6486)抗体及二抗(Santa Cruz公司),ECL plus(Bio-Rad公司)。

1.2 心力衰竭造模方法

参照本实验常用心力衰竭大鼠造模方法[6]。大鼠称体质量，给予100 g/L的水合氯醛3 mL/kg，麻醉后，暴露腹主动脉，并于双侧肾动脉上方钝性分离腹主动脉，用4号缝合线将腹主动脉和与腹主动脉平行放置的外径约0.6～0.9 mm的不锈钢丝一并结扎，然后轻轻取出不锈钢丝，使腹主动脉截面积缩窄至原来的25%～30%，造成腹主动脉狭窄，关腹。对照组钝性分离腹主动脉后，缝合线仅绕于腹主动脉上，并不缩窄，术后3 d内给予青霉素肌注(18 000 U/kg)，以预防感染。术后2周心脏彩超确诊心力衰竭后纳入实验。

1.3 实验分组

本研究分为对照组、心力衰竭组、3甲基腺嘌呤(3 methyladenine，3MA)组。对照组和心力衰竭组参照上述造模方法处理。3MA组在确诊心力衰竭后腹腔注射自噬特异性抑制剂3MA，15 mg/kg，连续两周。

1.4 大鼠心功能测定

大鼠颈部分离右颈总动脉, 插入充满肝素0.9%氯化钠注射液的导管,经压力转换器接 RM600 四导生理记录仪, 缓慢推进同时观察示波器,当导管进入左心室后停止推进, 测量左室舒张末压(LVEDP)、左室等容收缩期压力上升最大速率+dp/dtmax、左室等容舒张期压力下降的最大速率-dp/dtmax。

1.5 自噬相关蛋白检测

采用Western blot的方法，取大鼠心肌组织，组织匀浆裂解后，14 000 r/min离心5 min，4 ℃，取上清。提取大鼠心肌总蛋白后采用Bradford法进行蛋白定量。SDS-PAGE电泳后将蛋白转印至PVDF膜，采用5%牛血清白蛋白封闭1 h，TBST洗涤。一抗孵育过夜，TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h, ECL plus显色，Bio-Rad凝胶成像系统成像，并分析目的蛋白净光密度值。相对灰度值为目的蛋白与内参β-actin的比值,表示蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠心功能比较

心力衰竭组心功能指标LVEDP较对照组显著增加(P<0.05)，心肌收缩功能指标+dp/dtmax和舒张功能指标-dp/dtmax较对照组显著降低(P<0.05)。3MA组LVEDP较心力衰竭组显著降低(P<0.01)，+dp/dtmax和-dp/dtmax较心力衰竭组显著增加(P<0.01，P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠LVEDP、±dp/dtmax的比较

*P<0.01 compared with control group;#P<0.05，##P<0.01 compared with heart failure group(1 mmHg=0.133 kPa).

2.2各组大鼠心肌组织自噬相关蛋白beclin-1、cathepsinD表达的比较

心力衰竭组心肌组织beclin-1、cathepsin D表达较对照组显著增加(P<0.01)，而3MA组beclin-1、cathepsin D的表达较心力衰竭组显著减少(P<0.01)(图1)。

3 讨论

心力衰竭是多种病因引起心肌损害的最终结果，急性冠脉综合征、冠状动脉粥样硬化和高血压是导致心力衰竭的主要原因。高血压引起的心脏血液动力负担过重是心力衰竭的一个重要原因。自噬是一个高度保守的由溶酶体介导的细胞内蛋白质和细胞器再循环的细胞机制。在自噬的过程中，要被降解的蛋白或细胞器将被转运进双层囊泡——自噬体中[7]。通过这些过程，自噬能通过提供酶解物维持细胞中间代谢以及清除细胞内有毒或者受损的细胞或者细胞器，提高细胞在营养缺乏下的生存能力。自噬能被细胞内缺氧、饥饿、细胞内压力、应激等诱导[8- 9]。但近年来，不受控制的自噬在多种疾病的发生发展过程中的作用开始受到重视。本研究表现，心力衰竭大鼠在心功能下降的同时，心肌组织自噬相关蛋白beclin-1和cathepsin D表达较对照组显著增加，但在使用自噬特异性抑制剂3MA后，心力衰竭大鼠的心功能得到明显改善，且自噬相关蛋白beclin-1和cathepsin D显著降低，提示自噬在心力衰竭的发病过程中发挥着重要作用，采用自噬抑制剂可减轻心力衰竭心肌细胞自噬并改善心功能。因此，自噬可能成为心力衰竭治疗的潜在靶点，调节心力衰竭心肌细胞自噬是心力衰竭治疗的新策略。调节心力衰竭时失控的心肌细胞自噬，可减轻心肌细胞因自噬导致的心肌细胞死亡，这将有助于心力衰竭的治疗。目前，对于心肌压力负荷过重导致心肌细胞自噬的相关机制尚未阐明，有待进一步研究。寻找一种能应用于临床具有调节心肌细胞自噬的药物将可能有助于心力衰竭的治疗。

A.representative Western blot detection of beclin-1 and cathepsin D in the myocardium from controls, HF and 3MA rats; B.quantitative analysis of beclin-1 and cathepsin D protein expression relative to β-actin; *P<0.01 compared with control group； #P<0.01 compared with heart failure group

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Effect of cardiomyocyte autophagicdeath on cardiac function in a rat model of heart failure

WANG Ling-jun*, GAO Meng-xi, CHEN Jie, SUN Jing-he

(the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine； the Laboratory of Chinese Internal Medicine,National Key Disciplines, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

ObjectiveTo investigate the pathogenic role of cardiomyocyte autophagic death in heart failure.MethodsThirty SD rats were randomized into three groups: control group, heart failure group and 3-methyladenine(3MA) group. In heart failure group, heart failure was induced by abdominal aorta constriction. The 3MA, a specific inhibitor on autophagy was used in a heart failure model of rats induced by overload pressure. We examined the heart function of rats in three groups. In addition, we analyzed the expression of autophagy associated protein, beclin-1 and cathepsin D in rat hearts using Western blot.ResultsThe expression of beclin-1 and cathepsin D in the hearts of heart failure rats were significantly increased as compared those in control group(P<0.05). 3MA significantly improved cardiac function and significantly downregulated the expression of beclin 1 and cathepsin D in abdominal aorta constriction-induced failing heart.ConclusionsAutophagic cardiomyocyte death plays an important role in the pathogenesis of heart failure in rats induced by pressure overload.

autophagy; heart failure; 3-methyladenine; beclin-1; cathepsin D

2013- 12- 26

2014- 03- 24

国家自然科学基金(81102585，81373570);广东省自然科学基金(S2011040003510);中国博士后科学基金(20110490871)

*通信作者(correspondingauthor)：smu868@163.com

1001-6325(2014)08-1023-04

R 541.6

A