应用iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选乳腺癌患者血清差异表达蛋白

曹美群，孙珂焕，吴安民，陈德珩，吴正治

(1.暨南大学 第二临床医学院 深圳市老年医学研究所, 广东 深圳 518020；2.深圳大学 第一附属医院， 广东 深圳 518039)

研究论文

应用iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选乳腺癌患者血清差异表达蛋白

曹美群1，孙珂焕1，吴安民1，陈德珩1，吴正治2*

(1.暨南大学 第二临床医学院 深圳市老年医学研究所, 广东 深圳 518020；2.深圳大学 第一附属医院， 广东 深圳 518039)

目的筛选乳腺癌患者血清特异性表达蛋白，以寻找乳腺癌早期诊断的生物标志物。方法采集血清，提取蛋白，iTRAQ标记和ESI-QTOF-QⅡ质谱检测，再搜库和Scaffold软件分析，得到各组间血清差异表达蛋白。进一步采用Western blot验证差异蛋白。结果血清中共鉴定出335个蛋白，达到严格定量标准的蛋白151个；乳腺癌与对照组间共筛选出23个差异表达蛋白；乳腺癌与乳腺纤维瘤组间筛选出8个差异蛋白。Western blot验证Serotran-sferrin，Vitronectin，soform 1 of Gelsolin 3 个蛋白在各组中的表达结果与iTRAQ检测结果一致。结论本研究证实iTRAQ-LC-MS/MS 技术能够快速、有效地进行差异蛋白质组学研究，并筛选到多个与乳腺癌发病相关的血清蛋白，有可能作为乳腺癌早期诊断的生物标志。

乳腺癌；iTRAQ；蛋白质组学；血清；生物标志物

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。近年来，乳腺癌发病率在中国尤其是发达地区呈快速增长趋势，已跃居女性恶性肿瘤发病率之首[1]。目前临床上对乳腺癌早期诊断缺乏有效手段，血清蛋白质组学的出现为寻找有效的临床生物标志物提供了全新的方法。近年来同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术为解决低丰度蛋白的定性、定量研究提供了有效方法[2]。本研究应用最新的蛋白质组学定量方法iTRAQ标记法，探索乳腺癌患者的血清差异表达蛋白，寻找可能的生物标记,为乳腺癌早期诊断提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2008—2009年深圳市第二人民医院年龄在30～55岁初次发现乳腺肿块来就诊并经病理切片确诊为浸润性导管癌1期或2期患者45例，排除心脑血管和其他系统疾病以及精神神经系统疾病，在给予治疗和手术前采血。随机抽取20例分为乳腺癌1组和乳腺癌2组，用于iTRAQ-LC-MS/MS检测。同时选择年龄匹配的健康体检者和乳腺纤维瘤患者各35例作为对照，排除心脑血管等系统疾病以及精神神经系统疾病，两组各随机抽取10例用于iTRAQ-LC-MS/MS检测。乳腺癌、乳腺纤维瘤和对照组各25例用于Western blot蛋白验证。以上研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会批准，受试者在受试前知情同意并签署知情同意书。

1.2 材料和设备

胰蛋白酶(Gibco公司)，2D Quant Kit和iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit(Applied Biosystems公司)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取消化：取血清用层析柱Genway Seppro-TM去除高丰度蛋白，加入TCA沉淀蛋白，蛋白定量后每组取100 μg进行还原烷基化，再加入丙酮沉淀蛋白，复溶后加入Trypsin酶解。

1.3.2 iTRAQ标记、HPLC分离肽段： 每组样品对应1个分子质量(iTRAQ113-对照组，iTRAQ115-乳腺1组，iTRAQ117-乳腺癌2组，iTRAQ118-乳腺纤维瘤组)。将标记试剂加入异丙醇混匀后再加入对应样品液中反应2 h；标记后各组肽段混合，加入缓冲液A,调整pH 3.0，用phenomenex SCX(200 å,4.6 mm,250 mm)过柱分离。

1.3.3 MS/MS 鉴定：样品经Zip2tip微量层析柱脱盐, 反相柱分离，ESI-QTOF-MS鉴定。数据用DATA ANALYSIS 4.0(Bruker)分析。结果经MASCOTT 2.2搜库，Scaffold软件分析，变化倍数1.5倍以上为显著差异。

1.3.4 Western blot验证血清差异表达蛋白：提取蛋白，SDS-PAGE，转膜，一抗和二抗孵育，ECL显色，凝胶成像系统显像和数据收集。

1.4 统计学分析

SPSS11.5统计分析。计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确检验。

2 结果

2.1 血清蛋白质组鉴定结果

共检测到20596个肽段，去除重复冗余，共鉴定蛋白335个，达到定量标准的蛋白151个。

2.2 乳腺癌组与对照组之间血清差异表达蛋白

筛选到乳腺癌组与对照组间23个差异表达蛋白，包括2个表达上调蛋白和21个下调蛋白(表1),其中鉴定差异蛋白Isoform 1 of Gelsolin的一级和二级质谱图以及肽段的标记定量信息，见图1。

表1 乳腺癌组与对照组之间血清差异表达蛋白Table 1 The differentially expressed proteins in serum between breast cancer and control groups

续表1

A.MS spectrum of Isoform 1 of Gelsolin； B.MS/MS spectrum of Isoform 1 of Gelsolin； C.MS/MS spectrum of a triply charged peptide ion (at m/z =752.94，+2H),which is originated from Isoform 1 of Gelsolin; D.quantitative information of Isoform 1 of Gelsolin.

图1iTRAQ-LC-MS/MS鉴定蛋白Isoform1ofGelsolin的质谱图
Fig1ProteinidentificationandrelativequantificationusingiTRAQofIsoform1ofGelsolin

2.3乳腺癌组与乳腺纤维瘤组间血清差异表达蛋白

乳腺癌组与乳腺纤维瘤组之间筛选出8个差异蛋白(表2)。 其中Alpha-2-macroglobulin和Serotransferrin在两个乳腺癌组均明显高于对照组；Vitronectin在两个乳腺癌组表达明显低于对照组；Protein AMBP和Complement factor I在乳腺纤维瘤和乳腺癌组表达均低于对照组，但在乳腺纤维瘤组降低更为明显，因此这些蛋白有可能作为区分乳腺肿块良性和恶性的标志物。

2.4Westernblot验证乳腺癌患者血清特异性表达蛋白

验证结果证实，Isoform 1 of Gelsolin、Vitronectin在乳腺癌患者血清中的表达水平明显低于对照组，而Serotransferrin在乳腺癌患者血清中的表达明显高于对照组(图2)，与质谱鉴定结果一致。

3 讨论

21世纪初，生命科学研究步入了后基因时代，其核心便是蛋白质组研究。蛋白质组学方法应用于疾病研究，可以绘制蛋白质图谱，寻找疾病特异性蛋白标志物，并能提供治疗药物的候选靶点，为药物研制和筛选提供依据。iTRAQ技术是美国应用生物系统公司在2004年推出的一项新的同位素标记技术[2],为解决低丰度蛋白的定性、定量研究提供了有效的方法。本研究结果表明，iTRAQ技术结合LC-MS/MS技术能够快速、有效地进行差异蛋白质组学研究。

本研究从乳腺癌组与对照组间筛选到23个血清差异表达蛋白，其中Alpha-2-macroglobulin和Serotransferrin在乳腺癌组表达明显升高，另有 21个蛋白表达下调。该23个差异蛋白主要涉及机体的免疫反应、氧化应激、凝血功能及细胞黏附、迁移、增殖、分化和死亡等功能。其中Alpha-2-macroglobulin，Isoform 1 of Vitamin D-binding protein，Ceruloplasmin，Isoform 1 of Gelsolin，Pigment epithelium-derived factor，Serotransferrin，Vitronectin，zinc finger homeodomain 4，Isoform 1 of Fibronectin等蛋白已有相关研究显示与肿瘤的发生发展相关，其结果与本研究一致[3- 4]。因此，乳腺癌的发生发展主要与机体的免疫功能、细胞黏附、分化和死亡等机制相关，这些蛋白有可能成为乳腺癌早期诊断的候选标志物，值得进一步深入研究。

表2 乳腺癌组与乳腺纤维瘤组之间差异表达蛋白Table 2 The differentially expressed proteins in serum between breast cancer and breast fibroma groups

*P<0.05，**P<0.01 compared with control; #P<0.05，##P<0.01 compared with mammary fibroma图2 Western blot验证差异蛋白Fig 2 Protein expression in serum detected by Western blot

本研究同时从乳腺癌和乳腺纤维瘤之间筛查到8个差异表达蛋白，其中Alpha-2-macroglobulin是机体内一种蛋白水解酶抑制剂,通过对蛋白水解酶的调节, 发挥广泛的病理生理效应,与机体免疫状态, 特别是与细胞免疫有直接关系，清除自由基和抑制自由基产生，抑制肿瘤生长, 阻止肿瘤侵袭转移，在肿瘤方面的作用日益受到重视[5]。Serotransferrin作为肿瘤标志物, 其检测可帮助某些肿瘤的辅助诊断已为人们所公认，肿瘤患者在转铁蛋白增多的同时其氧化状态增强,转铁蛋白是铁的运载蛋白, 铁与之结合后束缚其参与自由基反应的能力, 从而抑制过氧化程度[6]。Vitronectin是一种黏着糖蛋白，与细胞内外多种蛋白相互作用，参与细胞黏附、组织入侵、 血管生成和转移等多种病理生理过程[7]。Isoform 1 of Elongator complex protein 4是一种RNA聚合酶，在染色质重构和组蛋白乙酰化中发挥着重要作用[8]。另外还有Keratin以及免疫蛋白因子Complement C5、Complement factor I和Protein AMBP 4个蛋白在组间表达差异均达1.5倍以上，但具体功能尚不清楚。这8个蛋白均可能为区分乳腺肿块良、恶性的生物标志物。但由于本研究样本量有限，结果需进一步大样本验证。

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Application of iTRAQ quantitative proteomicsin identification of serum biomarkers of breast cancer

CAO Mei-qun1, SUN Ke-huan1, WU An-min1, CHEN De-heng1, WU Zheng-zhi2*

(1.Shenzhen Geriatrics Research Institute, the 2nd Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen 518020;2.the First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhe 518039, China)

ObjectiveTo explore the presence of informative protein biomarkers of human serum proteome of breast cancer.MethodsSerum samples were profiled using iTRAQ technology coupled with LC-ESI-QTOF-MS, and Mascot searching. Western blot was used for validation of the candidate biomarkers.Results335 proteins were identified, and 23 proteins were associated with breast cancer. Three biomarker candidates generated from iTRAQ experiments were successfully verified using Western blot.ConclusionsThis result provides a global view of potential mechanisms and potentional biomarkers of breast cancer, and demonstrated that iTRAQ combined with LC-ESI-QTOF-MS quantitative proteomics is a powerful tool for biomarker discovery.

breast cancer; iTRAQ; proteomics; serum; biomarker

2013- 08- 09

2013- 11- 25

广东省自然科学基金(9152408801000016);广东省科技计划(73124)

*通信作者(correspondingauthor)： szwzz001@163.com

1001-6325(2014)01-1054-05

R 737.9

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