大环抗生素手性固定相拆分盐酸马布特罗对映体

张丹丹，王欣欣

（青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266042）

盐酸马布特罗是一种β2肾上腺受体激动剂，主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛［1］，其结构式见图1.盐酸马布特罗分子中含有一个手性中心，具有一对呈镜像对映关系的异构体，但目前应用的盐酸马布特罗均为外消旋体.手性化合物的对映体常具有不同的药理、毒理作用及药物动力学特征［2-5］，研究表明，在临床上有效的一般为其左旋体，而其右旋体则对疗效没有贡献［6］.因此，对盐酸马布特罗对映体进行拆分研究，建立简单、快速、灵敏、分离性能好的测定方法是一个具有理论及实际意义的课题.目前，对该药物的拆分报道较少，主要有高效液相色谱法和毛细管电泳法.如郭伟等人用自制3，4-二氯-万古霉素手性固定相分离了马布特罗对映体［7］，但分离度只有1.01；韩亚琼等人在自制替考拉宁手性柱上拆分了马布特罗对映体［8］，但分离度只有1.51，均未实现基线分离；另有杨晶等人用毛细管电泳法以多种环糊精为手性添加剂拆分马布特罗对映体的报道［9］.本文作者采用三种大环抗生素类手性固定相Chirobiotic V，T和R（结构式见图2）对盐酸马布特罗对映体直接进行了分离，考察了分离模式、流动相组成及柱温的影响，并研究了对映体的热力学行为，探讨了手性分离的机制.

图1 马布特罗的结构式Fig.1 Structure of mabuterol

图2 三种大环抗生素类手性固定相的结构式Fig.2 The structures of macrocyclic antibiotic chiral stationary phases

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Jasco UV-980型高压输液泵，Jasco UV-975型检测器（Jasco日本分光公司），IC 2001plus型柱温箱，Anastar色谱工作站，U6K型进样阀（20μL定量环），DT-100A型分析天平，PHS-25型pH计，DL-180型超声波清洗机.

盐酸马布特罗由青岛双鲸药业提供；甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯（天津市康科德科技有限公司）；冰醋酸、三乙胺、硝酸铵均为特级纯（天津市博迪化工有限公司）.

1.2 色谱条件

色谱柱：Chirobiotic V（250×4.6mmI.D.，5m），Chirobiotic T（150×4.6mmI.D.，5m）和Chirobiotic R（250×4.6mmI.D.，5m）色谱柱（Advanced Separation Technologies Inc.，美国）.流动相：甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）.流速1.0mL/min；紫外检测波长254nm；进样量20μL.马布特罗对照品用甲醇溶解，配制成浓度为1.0g/L的供试液.

2 结果与讨论

2.1 新极性有机相模式下盐酸马布特罗对映体的分离

大环抗生素类手性固定相有正相、反相和新极性有机相三种分离模式.由于此类固定相的大环抗生素类结构中具有可离子化基团，所以可以将流动相组成转变为100%甲醇，添加适量的有机酸和碱来改善其对对映体的选择性.当被分析物的分子结构中含有一个以上可以与手性固定相的手性位点发生相互作用的官能团时，新极性有机相模式就可以被使用，而且是首选的分离模式.本文中盐酸马布特罗的结构中含有多个可以与手性固定相的手性位点发生相互作用的官能团，如卤素，羟基，氨基和苯基等，因此新极性有机相模式被确定为首选的分离模式.

2.1.1 缓冲溶液类型对分离的影响

在新极性有机相模式下，化合物的保留行为和对映体选择性主要受有机酸和有机碱的浓度和比例的影响.考察了0.1%醋酸铵、0.1%硝酸铵和0.1%醋酸三乙胺三种缓冲系统对分离的影响，结果发现，盐酸马布特罗在0.1%醋酸铵和硝酸铵缓冲系统中完全不能实现分离，且色谱峰拖尾，对称性较差；而在0.1%醋酸三乙胺缓冲系统中可以得到一定的手性分离，因此在后续实验中选用0.1%醋酸三乙胺做为流动相的缓冲系统.

2.1.2 缓冲溶液浓度对分离的影响

以甲醇-冰醋酸-三乙胺系统作为流动相，考察了冰醋酸和三乙胺的浓度和比例对分离的影响.在Chirobiotic R手性固定相上，无论如何优化条件，盐酸马布特罗对映体均不能实现分离.在Chirobiotic V和T手性固定相上，当流动相中只含有冰醋酸而不含有三乙胺时，均只能检测到一个变形的色谱峰，不能实现手性分离；在含有三乙胺的流动相中，盐酸马布特罗可实现一定的分离，冰醋酸的加入对化合物的手性识别不起主要作用，但可以改善色谱峰的峰形和对称性.采用甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.1∶0.1，V/V/V）为起始流动相，考察了缓冲液成分（冰醋酸/三乙胺）的浓度对盐酸马布特罗在Chirobiotic V和T手性固定相上保留行为和对映体选择性的影响.随着冰醋酸/三乙胺的浓度从0.1%降低至0.02%或0.01%，盐酸马布特罗保留时间明显延长，分离效果显著提高；但当冰醋酸/三乙胺的浓度继续降低至0.005%时，保留时间过长，色谱峰展宽，分离效果下降.具体数据见表1.由此确定甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）为最佳流动相，在此条件下，盐酸马布特罗在Chirobiotic V和Chirobiotic T手性固定相上均可实现基线分离，分离色谱图见图3.

表1 流动相组成对盐酸马布特罗对映体保留行为和分离的影响Table 1 Effect of mobile phase compositon on retention，separation factor and resolution factor of mabuterol on Chirobiotic V and T CSPs

图3 盐酸马布特罗对映体在Chirobiotic V和T手性固定相上的分离色谱图Fig.3 Enantioseparaion chromatograms of mabuterol on Chirobiotic V and T CSPs

2.1.3 柱温对分离的影响及热力学性质研究

本文作者研究了柱温变化对盐酸马布特罗在Chirobiotic V和T手性固定相上保留行为和对映体选择性的影响，以甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）为流动相，考察了在10，20，30和40℃下的分离情况.随着温度的降低，盐酸马布特罗的保留时间延长，对映体选择性有所提高，具体数据见表2.权衡分离度，保留时间及实际操作性，选取最佳分离温度为20℃.

表2 温度对马布特罗在替考拉宁手性固定相上分离效果的影响Table 2 The effects of temperature on retention，separation factor and resolution factor of mabuterol on Chirobiotic V and T chiral stationary phases

根据Van’t Hoff等式，色谱参数、柱温和热力学参数的关系为：lnα＝-ΔH/（RT）＋ΔS/R，式中R为气体常数，T为绝对温度，ΔH和ΔS分别代表对映体与手性固定相相互作用的焓变差和熵变差.在表2考察的温度范围内，得到盐酸马布特罗在Chirobiotic V手性固定相上的ΔH和ΔS分别为-198.42kJ/mol和-0.38J/mol，在Chirobiotic T手性固定相上的ΔH和ΔS分别为-401.72kJ/mol和-0.95J/mol，数值均为负值，表明其手性识别过程均为焓控过程.

2.2 反相模式下盐酸马布特罗对映体的分离

大环抗生素类手性固定相在反相模式下其保留行为和选择性主要受有机改性剂的性质和浓度，缓冲盐的性质、浓度和pH的影响.本文作者通过优化这些分离条件，在Chirobiotic V手性固定相上可使马布特罗对映体部分分离；但在Chirobiotic T和Chirobiotic R手性固定相上均不能实现分离.

在Chirobiotic V手性固定相上，硝酸铵在多数情况下已被证明是最佳选择，为厂家建议使用的缓冲盐.但在本文中，通过分离效果的比较，三乙胺醋酸缓冲盐（0.1%TEAA）被证明分离效果更佳.在该固定相所适应的pH范围内（4.0～7.0）考察了缓冲盐pH的变化对分离的影响.当缓冲盐的pH在5.5～7.0时，马布特罗对映体可以得到一定的分离；但当缓冲盐的pH低于5.5时不能实现分离.在反相模式下，可选用的有机改性剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃等，本文考察了它们的类型和浓度对马布特罗对映体保留行为和分离效果的影响.乙醇被证明是适用于此固定相的最佳选择；当采用异丙醇或四氢呋喃作为有机改性剂时分离效果较差；采用甲醇或乙腈时不能实现手性分离.随着乙醇在流动相中含量由10%增加至70%，马布特罗的保留时间随之延长，而分离因子和分离度在流动相中含有30%乙醇时达到此模式下的极大值.其中乙醇含量对化合物保留行为的影响不符合通常的反相行为，这表明离子化作用在化合物洗脱和对映体分离时具有决定性作用.因此，此模式下最佳流动相被确定为0.1%TEAA（pH 6.0）-30%乙醇，流速0.6mL/min.在此流动相条件下，马布特罗对映体可实现部分分离，分离因子（α）和分离度Rs分别为1.04和0.22.

2.3 正相模式下马布特罗对映体的手性分离

在正相模式下，考察了两种流动相系统：正己烷/乙醇和正己烷/异丙醇，并且通过改变流动相组成以求实现手性分离.令人失望的是，在此模式下，盐酸马布特罗对映体在三种大环抗生素手性固定相上均不能实现分离.

2.4 分离机制的探讨

万古霉素，替考拉宁和利托菌素分别是Chirobiotic V，T和R色谱柱的手性选择剂，它们的结构十分复杂，含有不同的手性中心，包合空腔和各种官能团.由于其结构的复杂性，它们可与被分离的对映体发生π-π相互作用，氢键作用，包合作用，偶极作用，立体化学作用和离子相互作用.盐酸马布特罗的结构中具有苯环，羟基，卤素和氨基基团，可以与手性选择剂上相应的官能团发生相互作用从而实现手性分离.新极性有机相模式可以提升所有这些相互作用，因此在此模式下，盐酸马布特罗对映体可实现较好的分离.而在新极性有机相模式下，必须有三乙胺存在于流动相中才可实现对盐酸马布特罗对映体的分离，当流动相中同时含有三乙胺和冰醋酸时，分离效果最佳，这说明离子作用是此模式下对映体分离的最主要作用机制，而盐酸马布特罗的手性分离是上述提到的各种相互作用的共同结果.

在反相模式下，马布特罗对映体的分离受流动相中缓冲盐pH的影响很大，这是因为马布特罗和手性固定相的结构中均含有可离子化基团，流动相的pH能够影响它们的离子化状态以及手性选择剂的构型，从而影响两者之间的离子相互作用，进而影响分离结果，这说明在反相模式下，离子相互作用也是影响对映体分离的最主要作用.当考察流动相中有机溶剂含量对保留行为和分离的影响时，发现其保留时间的变化不符合通常的反相行为，随着流动相中乙醇含量的增加，分析物的保留时间反而延长，亦表明离子化作用在化合物洗脱和对映体分离时具有决定性作用.

在正相模式下，盐酸马布特罗对映体不能得到分离，这进一步证明了离子相互作用在盐酸马布特罗对映体分离时的必要性.因为离子相互作用在正相模式下是很难，甚至不可能发生的，而盐酸马布特罗对映体分离最主要的机制就是通过离子相互作用，所以才致使其对映体在正相模式下不能实现分离.

盐酸马布特罗对映体在Chirobiotic V和T固定相上均可得到较好的基线分离，而在Chirobiotic R固定相上却没能实现手性分离，这主要是由于三种固定相的手性选择剂的结构存在差异.尽管替考拉宁和利托菌素的结构有些相似，但是两者之间最显著的差异就是在利托菌素的结构中含有相对多的半糖结构，但缺少羧基.盐酸马布特罗对映体在Chirobiotic R固定相上不能实现分离的现象表明固定相结构中的羧基是与被分析物发生离子相互作用的重要手性位点之一，而且进一步证明了离子相互作用是实现对映体分离的最必要作用.手性固定相中的半糖等结构可以为对映体提供手性空腔，使对映体由于立体结构差异而实现手性分离.因此，盐酸马布特罗对映体在Chirobiotic R固定相上不能实现分离的现象可以解释为Chirobiotic R固定相缺少能与分析物发生离子相互作用的位点，且由半糖结构所形成的手性空腔不适合盐酸马布特罗对映体的分离.

3 结论

采用三种大环抗生素类手性固定相Chirobiotic V，T和R对盐酸马布特罗进行了拆分研究，在Chirobiotic V，T手性固定相上成功实现了其对映体的基线分离，最大分离度可分别达3.08和3.73.本文中建立的盐酸马布特罗拆分方法简单，操作方便，可以用于其对映体的质量控制及立体选择性药代动力学的研究.

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