基质金属蛋白酶在奶牛子宫内膜组织中的表达

崔晓妮，陶 爽，刘祥新，田文儒，曹荣峰

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2.山东省日照市园林管理局，山东 日照 276800）

动植物中广泛分布的基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases,MMPs)是降解细胞外基质（ECM）必不可少的酶，几乎能降解ECM的所有成分[1]，其参与胚胎的发育及组织重塑，并在多种病理过程中发挥作用，如炎症、类风湿性关节炎、恶性肿瘤、动脉粥样硬化、脑血管病和多发性硬化等过程[2]。奶牛子宫内膜炎是常见的产科病，该病给奶牛养殖业带来巨大的经济损失。研究MMP-2、MMP-9与人慢性子宫内膜炎和不孕症之间的关系发现，可以用MMP-2和MMP-9评估子宫内膜的状态。但奶牛子宫内膜组织中MMPs能否对奶牛子宫内膜炎的诊断与治疗提供参考，尚缺乏试验证实。为此，笔者通过采集患子宫内膜炎奶牛的子宫内膜组织样本，检测MMP-2、MMP-9的mRNA表达及酶活性，来阐明奶牛子宫内膜炎与MMPs之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料 选择未配种的健康奶牛和患子宫内膜炎奶牛，分别收集子宫。

1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶和DNA Marker，购自（大连）TaKaRa公司；EASY spin组织/细胞RNA快速抽提试剂盒，购自原平皓（天津）生物技术有限公司；BioRT cDNA第一链合成试剂盒，购自杭州博日科技有限公司；明胶酶谱法和组织切片的常规试剂。

1.3 主要仪器 UVP：Bio-Rad；PCR仪：Bio-Rad；-80℃低温冰箱（725型）：Sanyo；台式离心机：Sigma；生物显微镜：OLYMPUS；组织切片机等。

1.4 奶牛子宫内膜上皮组织切片的制作 根据组织切片的要求，分别取子宫内膜制作常规的组织切片。切片进行常规H.E.染色，染色完成后封片，并在显微镜下观察组织形态学变化。

1.5 奶牛子宫内膜组织总RNA的提取及cDNA的合成 剪取奶牛子宫内膜分装于冻存管中，-70℃保存。按EASY spin组织/细胞RNA快速抽提试剂盒的操作方法抽提细胞总RNA，按BioRT cDNA第一链合成试剂盒的操作方法获得样品cDNA。

1.6 奶牛MMP-2、MMP-9及GAPDH的引物合成如表1所示，MMP-2、MMP-9及内参GAPDH的引物设计参考Birendra[3]，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物设计

1.7 奶牛子宫内膜组织MMP-2和MMP-9 mRNA的PCR检测法 50 μL PCR反应体系：10×RT Buffer 5.0 μL、dNTP Mixture 5.0 μL、上游引物2.0 μL、下游引物2.0 μL、MgCl2（25mmol/L）、模板2.0 μL、Fermentas Taq（5 U/μL）0.25 μL、灭菌蒸馏水27.95 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸1 min；30个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，由凝胶成像分析系统拍照鉴定，用Glyko Band Scan 5.0对试验结果进行灰度扫描，计算mRNA的相对表达量：mRNA相对表达量=目的基因条带光密度值/对应的GAPDH条带光密度值。

1.8 明胶酶谱法检测奶牛子宫内膜组织中MMP-2、MMP-9的活性 制备含1%明胶的分离胶，进行SDS-PAGE电泳，上样量为16 μL/孔，4℃、100 V电泳1.5 h。取出凝胶洗脱40 min×2次，漂洗20 min×2次，置37℃孵育液中42 h，染色液3 h，分别置脱色液A、B、C中脱色0.5、1、2 h，用Glyko Band Scan 5.0分析读取灰度值，做统计分析。

1.9 数据处理 应用SPSS 12.0软件进行数据的分析处理，采用ANOVA法进行组间差异性的比较。

2 结果

2.1 患子宫内膜炎奶牛子宫内膜形态学变化 肉眼观察患子宫内膜炎奶牛的子宫发现，子宫肥大，剖检可见子宫壁肥厚，子宫内膜出血和水肿，子宫腔内有大量浑浊、黏稠、黄白色的脓性分泌物。

图1 对照组奶牛子宫内膜上皮组织 （H.E.400×）

图2 子宫内膜炎患牛子宫内膜上皮组织 （H.E.400×）

分别对患病组和对照组奶牛子宫进行组织切片观察发现，对照组奶牛子宫内膜上皮细胞排列整齐，黏膜下层细胞疏松且有规律。患病组奶牛子宫内膜上皮有破损和脱落现象，上皮层有零散的炎性细胞浸润，黏膜下层炎性细胞明显浸润，有淤血现象。

2.2 奶牛子宫内膜组织中MMP-2、MMP-9和GAPDH基因的PCR鉴定 分别对患病组和对照组奶牛子宫内膜组织中的MMP-2、MMP-9和GAPDH基因进行PCR扩增，电泳结果如图3。从图3可以发现，对照组和患病组分别在预期位置出现了条带，其分子量与预期大小一致。用Glyko BandScan软件扫描各组基因条带灰度，计算内参比并取平均值作为mRNA的相对表达量，其结果见表2。从表2可以看出，患病组织中MMPs的mRNA含量显著高于对照组（P＜0.05）。

表2 奶牛子宫内膜MMP-2、MMP-9mRNA的变化

2.3 奶牛子宫内膜组织中MMP-2、MMP-9的酶活性鉴定 用明胶酶谱法分别检测患病组和对照组奶牛子宫内膜组织中MMP-2和MMP-9的酶活性，结果看出分别在72 kD和92 kD处出现了条带，分别是MMP-2和MMP-9的预期位置。扫描各组蛋白条带的灰度值，取平均值，结果见表3。从表3可以发现，患病组MMP-2和MMP-9的酶活性显著高于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

试验证实，MMPs可直接参与免疫应答，在炎症反应过程中既能抵御也能促发炎症。研究显示，在自身免疫性脑炎、缺氧性脑损伤和其他中枢神经系统炎症中，MMP-2和MMP-9通过分解闭锁蛋白来调节内皮的通透性和炎症发生[4-5]。

表3 奶牛健康/患病子宫内膜组织中MMP-2、MMP-9的酶活性

子宫内膜的MMPs能参与子宫内膜的重建、囊胚的种植及滋养层细胞的浸润[6]。Keiichiro等[7]曾经报道，奶牛妊娠期子宫内膜及胎盘均表达MMP-2和MMP-9，MMP-2 mRNA表达随妊娠先下降再增强；而MMP-9 mRNA表达相对稳定，认为MMPs参与了子宫内膜的改造。而Soboleva等[8]认为，检测血清中MMP-2可以监控慢性子宫内膜炎的发生及治疗效果。据此，我们推测这两种MMP在子宫复旧、子宫内膜炎的发生发展过程中也应起着重要的作用。

本试验发现，所采集的患子宫内膜炎奶牛子宫组织中MMP-2和MMP-9的mRNA表达均显著高于对照组，且其酶活性也显著高于对照组，验证了上述推测。本试验结果也说明奶牛患子宫内膜炎时，奶牛通过调控子宫内膜组织中明胶酶的含量，来降解子宫内膜组织中的EMC，松弛子宫壁从而促进炎性细胞浸润，起到促进奶牛子宫局部炎症发生发展的作用。

[1]陈华江，王杰军.基质金属蛋白酶的结构及其调节机制[J].国外医学肿瘤学分册，2001，28(1):20-23.

[2]高颖，蔡定芳.基质金属蛋白酶-9与炎症反应研究进展[J].中国病理生理杂志，2003，19(8):1133-1136.

[3]Biredra M，Keiichiro K，Katsuo K，et al.Expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer(EMMPRIN)and its related extracellular matrix degrading enzymes in the endometrium during estrous cycle and early gestation in cattle[J].Reproductive Biology and Endocrinology，2010，8:60.

[4]Svedin P，Hagberg H，Savman K，et al.Matrix metalloproteinase-9 gene knock-out protects the immature brain after cerebral hypoxia-ischemia[J].Neurosci，2007，27(7):1511-1518.

[5]Rosenberg G A.Matrix metalloproteinases in neuroinflammation[J].Glia，2002，39（3）:279-291.

[6]Hulboy D L，Rudolph L A，Matrisia L M.Matrix metalloproteinases as mediators of reproductive function[J].Molecular Human Reproduction，1997，3:27-45.

[7]Keiichiro K，Koichi U，Toru T，et al.Gelatinase(MMP-2 and-9)expression profiles during gestation in the bovine endometrium[J].Reproductive Biology and Endocrinology，2008，6:66.

[8]Soboleva G M，Shurshalina A V，Sukhikh G T，et al.Serum activity of matrix metalloproteinases-2 and-9[J].Bull Exp Biol Med,2006，141（2）:247-249.