金黄色葡萄球菌产肠毒素规律的初步研究

冯翠兰，刘富来

（佛山科学技术学院，广东 佛山 528231)

金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）主要是由血浆凝固酶或耐热核酸酶阳性的菌株所产生的一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，为单肽链蛋白质[1]。近年来的研究表明，金黄色葡萄球菌肠毒素具有独特高效的诱导机体抗肿瘤免疫反应的特性，把它作为抗肿瘤生物制剂，应用于抗肿瘤疗法中，将会有广泛的应用前景[2-3]。

食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，由金黄色葡萄球菌及其肠毒素引起的中毒案例越来越多，占细菌性食物中毒第一位，而携带SEA-SEE基因的金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占金黄色葡萄球菌食物中毒的95%，SE引起的食物中毒和其他相关疾病给我们的生活带来很大的威胁，由此造成的经济损失也相当严重[4]。金黄色葡萄球菌食物中毒是因进食含有肠毒素的食物，并非活菌所引起，传统常规法检测肠毒素需要经过增菌、分离培养、生化鉴定等一系列繁琐步骤来完成，比较复杂、不敏感，费时费力，全过程大概需要4～8 d，在基层单位难以做到。而且由于该菌广泛存在，仅检出金黄色葡萄球菌，而无肠毒素的检出，是很难作为食物中毒主要依据来判断。近年来，国际上已将肠毒素检测列入食品检验法规。因此，建立敏感、快速、特异的食品中的肠毒素检测方法，是食品检测的一项重要研究内容，对疾控系统快速检出结果有重要作用，对于保证食品安全卫生有着十分重大的现实意义[5-6]。

因此，研究金黄色葡萄球菌产肠毒素规律，有利于弄清肠毒素的产生情况和进行量的提取扩增，促进肠毒素快速检测方法的建立和抗癌产品的研发，对于保障食品安全和临床医学抗肿瘤有重要意义。

1 材料与方法

1.1 金黄色葡萄球菌 质控金黄色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和肠毒素产毒培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司提供；产肠毒素金黄色葡萄球菌（SEF101）由佛山科学技术学院食品科学实验室保存，自病例中分离鉴定[7]。

1.2 仪器和试剂 全自动荧光/化学发光分析仪(SpectraMax M2e)，美 国 Molecular Devices生 产 ；YLN-30电脑控制菌落计数器，北京亚力恩科学器材公司生产；PYX-190Z-C震荡培养箱，广东韶关科力实验仪器有限公司生产；透析袋（截留分子量14 000），上海源聚生物科技有限公司提供；葡萄球菌肠毒素SET检测试剂盒，上海博舜生物科技有限公司提供。

1.3 金黄色葡萄球菌肠毒素提取和测定 取金黄色葡萄球菌单菌落，接种于肠毒素产毒培养基中，依据金黄色葡萄球菌及其肠毒素检测方法（GB/T4789.10-2003）中的液体透析培养法[8]，置通过充补氮气和加脱氧剂的方法控制空气中含氧量的密闭培养装置中摇振(100 r/min)培养，定时对透析袋外的培养液用全自动荧光/化学发光分析仪进行SE含量测定（本研究所测肠毒素为A-E混合体），吸取培养液后重新调整装置中空气含氧量至设置水平。

1.4 肠毒素较优制备条件的单因素试验

1.4.1 培养温度对产量的影响 调整培养装置中空气含氧量为14.5%，分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃培养40 h，测定培养液中SE的含量。

1.4.2 含氧量对产量的影响 设定培养温度为35℃，依据动态测量含氧量小于±0.5%进行控制，使整个实验过程的平均含氧量接近所设定12.5%、13.5%、14.5%、15.5%、16.5%环境中培养40 h，测定培养液中SE的含量。

1.4.3 产毒培养时间对产量的影响 设定培养温度为35℃，空气含氧量为14.5%的环境中分别培养20、30、40、50、60 h，测定培养液中SE的含量。

1.5 肠毒素制备条件的正交试验 将培养温度、培养环境空气含氧量和产毒培养时间作为因素，按照单因素试验结果，选取产量最多的水平进行组合，3个因素的3个水平（表1）共同作用，观察SE产生情况。

表1 正交试验因素与水平

1.6 金黄色葡萄球菌产SE的特性观察 质控金黄色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和产SE金黄色葡萄球菌（SEF101）分别在最优工艺条件下培养，每隔2 h对透析袋外的培养液用全自动荧光/化学发光分析仪进行SE含量测定，观察金黄色葡萄球菌产SE的规律。

2 结果和分析

2.1 肠毒素较优制备条件的单因素试验结果

2.1.1 培养温度对SE产量影响的结果 培养装置中空气含氧量为14.5%培养40 h，于25℃～40℃时培养液中SE的含量呈上升的趋势，40℃达最大值，40℃～45℃呈下降的趋势（图1），温度对金黄色葡萄球菌产生肠毒素有较大影响，40℃的环境有利于金黄色葡萄球菌产生SE。

2.1.2 含氧量对SE产量影响的结果 于35℃培养40 h，空气含氧量为13.5%～14.5%时培养液中SE的含量呈上升的趋势，14.5%～17.5%时呈下降的趋势（图2），环境中空气含氧量对SE产生有明显影响，含氧量太高或过低均不利于金黄色葡萄球菌产生SE，空气含氧量为14.5%时有利于金黄色葡萄球菌产生SE。

2.1.3 产毒培养时间对SE产量影响的结果 空气含氧量为14.5%，培养温度为35℃，培养时间为0～40 h时培养液中SE的含量呈快速上升的趋势，40～60 h培养液中SE的含量增长缓慢趋于稳定（图3），表明培养40 h后金黄色葡萄球菌基本停止产生SE。

2.2 肠毒素制备条件的正交试验结果 从表2正交试验结果的极差分析得出3个因素对试验结果的影响程度为：产毒培养时间＞产毒培养温度＞环境中氧含量，其中产毒培养时间这个因素对本试验最为重要，在本次3因素3水平正交试验设计中，其优方案为A3B2C2，即采用产毒培养时间40 h，培养温度40℃，环境中氧含量15.5%的条件下，SE产量最大，高达59.31 mg。该试验结果和其他正交处理间差异显著，故产毒培养时间40 h，培养温度40℃，环境中氧含量15.5%为本次正交试验中的最优条件。

表2 金黄色葡萄球菌产SE的正交试验

2.3 金黄色葡萄球菌产SE曲线测定 根据国标（GB/T4789.10-2003）规定方法在控制空气含氧量和设定温度的条件下，在最优工艺条件下培养质控金黄色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和产肠毒素金黄色葡萄球菌（SEF101），通过观察图4可知，培养6 h培养液即可检测到SE存在，之后进入一个缓慢增加的过程直至16 h，接着16～40 h为金黄色葡萄球菌提取液SE含量快速增加过程，40～60 h为稳定期，SE含量增加不明显（图4）。质控金黄色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和产SE金黄色葡萄球菌（SEF101）SE含量变化情况未见明显差异。

3 讨论

通过单因素试验和正交试验得到金黄色葡萄球菌SE产量最大的最优工艺条件。产毒培养40 h，培养温度为40℃，环境中氧含量15.5%的条件下，SE产量最大，单个菌落SE产量为59.31 mg，3个因素对SE产量的影响程度为：产毒培养时间＞产毒培养温度＞环境中氧含量，其中产毒培养时间对本试验最为重要，在合适的环境氧含量条件下选择适宜的温度可促进SE的产生。金黄色葡萄球菌产SE曲线表明，培养6～8 h即可检测到SE的存在，但在40 h后培养液中SE的含量不再明显增加。因此，作为SE快速检测，使用全自动荧光/化学发光分析仪最快可在在6～8 h给出确切判断。

SE作为一种抗肿瘤生物制剂，具有良好的应用前景，获得大量纯度高成分清晰的SE是它的前题，而本研究结果表明，金黄色葡萄球菌在合适的温度和氧含量条件下，培养40 h即可得到SE最大产量。李献和马家斌及林新坚等[9]发现金黄色葡萄球菌临床分离株在蘑菇罐头中生长良好，当菌数达到107 CFU/mL时即可检测出SE，随后大量积累，培养18 h及以各阶段SE检测结果均为阳性，这与本研究结果基本一致。

[1]罗海波，鲍行豪.细菌毒素研究进展[M].北京：人民卫生出版社，1983.

[2]Shimizu M，Matsuzawa A，Takeda Y.A novel method for modification of tumor cells with bacterial superantigen with a heterobifunctional cross-linking agent in immunotherapy of cancer[J].Mol Biotechno1，2003，25(1):89-94.

[3]胥全彬，张艳红，张雷雷，等.重组金葡菌肠毒素A的抗癌效应研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2005，12(2):103-106.

[4]陈智，江元山，熊燕，等.金黄色葡萄球菌食物中毒分离株毒素基因的PCR分析[J].中国卫生检验杂志，2009，19(1):21-23.

[5]刘飞，李永明，金伯泉.金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，26(5):511-513.

[6]任天红，刘景武，付素兰.金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的应用及进展[J].河北医药，2008，30(8):1224-1226.

[7]刘富来，冯翠兰.一株产肠毒素金黄色葡萄球菌致死小鼠的初步研究[J].中国动物检疫，2010（4）:50-51.

[8]GB/T4789.10-2003.食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验国家标准[S].

[9]林新坚，陈济深，杨佩玉，等.蘑菇罐头中金黄色葡萄球菌肠毒素研究概况[J].福建农业科技，1994，（5）：23.