15株禽源沙门菌的分离鉴定与耐药性试验

吴 白，杨 林，吴婷婷，刘 阳，王彦红，刘文博

（扬州大学兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 江苏 扬州 225009）

沙门菌感染可引起禽类各种各样的急性和慢性疾病，感染禽也是经食物链传染给人的一个重要宿主。目前本菌属至少已有2 500多个血清型，但只有约10%分自家禽，并且其中少数几个血清型占了禽沙门菌分离株的绝大多数[1]。沙门菌在自然界的分布比较广泛，有些是人及动物共染的病原菌；在动物中，多种畜禽及野生动物均可被感染。自从抗生素的出现，沙门菌曾得到有效的控制，但是随着抗生素的长期使用，越来越多的耐药菌株出现，使得本病的发病率和死亡率都不断上升，一方面制约养殖业的健康发展；另一方面导致全世界人沙门菌感染逐渐上升，尤其是食物中毒不断增多[2-3]。因此，为控制耐药性沙门菌感染的蔓延，研究畜牧业中抗菌药物的使用造成沙门菌耐药性的变化，加大对沙门菌耐药性检测力度是非常必要的。为了能够更好地控制其在家禽中的传播，我们对疑似沙门菌的病料进行分离鉴定，并对其流行特点和耐药性进行分析，为有效防治沙门菌感染提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 血清营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，按通用的组方自行配制。其中麦康凯琼脂粉，购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司；琼脂粉与氯化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨与胰酶，购自OXOID公司；肠杆菌科细菌生化管和药敏试纸，购自杭州天和微生物试剂有限公司；沙门菌属诊断血清，购自中国生物技术集团公司兰州生物制品研究所；16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit，购自TaKaRa公司。

1.2 细菌分离 无菌采集2012年2月-7月送检禽类的肝脏、心、卵等病料划线接种于血清营养琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，37℃倒置培养24～48 h后，观察结果。取单个菌落进行革兰染色镜检，观察细菌形态及染色特性。

1.3 生化试验 取纯化的菌株接种于肠杆菌科细菌生化管，37℃培养24～48 h。利用细菌微量生化反应管对所分离菌株进行生化指标测定。

1.4 血清型鉴定 取洁净的玻片，加少量沙门菌诊断血清，再用灭菌的接种环挑取纯化的单个菌落与血清充分混匀。2 min内观察是否有凝集现象出现，根据鉴定出的O抗原和H抗原，查阅Kauffman-White沙门菌抗原式即可确定被检菌的菌型。

1.5 16S rDNA基因测序法 将分离细菌采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模板，按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法操作进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，切胶送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序；将测定的序列在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST）进行BLAST搜索比对，鉴定细菌种属。同时将15株分离菌的16S rDNA基因序列和参考株CQ0709用MEGA version 4软件分析[5]。

1.6 药敏试验 采用世界卫生组织（WHO）推荐的Kirby-Bauer法进行药敏试验，判定标准参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS，2009）公布的标准。药敏纸片：头孢曲松钠（30 μg/片）、诺氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）、复方新诺明（23.75 μg/片）、痢特灵（300 μg/片）、罗美沙星（10 μg/片）、美洛西林（75 μg/片）、多粘菌素 B（300 μ/片）、萘啶酸（30 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、庆大霉素（10 μg/片）、强力霉素（30 μg/片）、链霉素（10 μg/片）。

2 结果

2.1 细菌分离 从送检病料中分离得到的15株细菌，在血清营养琼脂上长出乳白色、圆润菌落；在麦康凯琼脂上培养48 h可见灰白色菌落，生长缓慢。纯化后的15株分离菌株分别命名为：S 01、S 02、S 03、S 04、S 05、S 06、S 07、S 08、S 09、S 10、S 11、S 12、S 13、S 14、S 15。S 01～S 08来源于鸡，S 09～S 12来源于鹅，S 13为来源于鹧鸪，S 14来源于鸽，S 15来源于鸭。无菌采取在麦康凯板上纯化的单个菌落进行革兰染色，镜检可见革兰阴性杆菌，多为散在排列。

2.2 生化试验 15株分离菌株都能发酵葡萄糖、果糖、甘露醇，不发酵乳糖、蔗糖，赖氨酸、鸟氨酸、甲基红（M-R）试验阳性，不水解尿素，不产吲哚，V-P试验阴性。有1株能发酵麦芽糖，但不产生硫化氢；有7株能发酵麦芽糖和产生硫化氢；其余的都不发酵麦芽糖，不产生硫化氢。分离菌的生化结果显示，其基本符合沙门菌的特性。

2.3 血清型鉴定 15株疑似沙门菌其血清型与鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡白痢的抗原模式基本相一致，初步判定分离菌株血清型为7株鼠伤寒沙门菌，5株伤寒沙门菌，2株肠炎沙门菌，1株鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。

2.4 16S rDNA基因测序法 用16S rDNA试剂盒扩增分离菌的16S rDNA片段后进行琼脂糖凝胶电泳，将500 bp的目的片段切胶经上海生工生物工程技术服务有限公司测序；将测定的序列在NCBI网站进行BLAST搜索比对，结果结合生化试验、血清学试验确定所分离细菌血清型：S 01、S 09、S 10、S 11、S 12、S 14、S 15为鼠伤寒沙门菌；S 02、S 03、S 04、S 05、S 13为伤寒沙门菌；S 06、S 08为肠炎沙门菌；S 07为鸡白痢沙门菌。参考株肠炎沙门菌株CQ0709来自于GenBank序列号为FJ465088.1，15株分离菌的16S rDNA序列上传GenBank后获取相应的序列号：S01-S15分别为JX888143，JX888149，JX888151-JX8881 63。15株沙门菌16S rDNA序列同源性达97%以上（图1）。

2.5 药敏试验 15株细菌对15种药物的耐药性根据所选择抗菌药物的抑菌圈大小与敏感标准来判定，药敏试验结果显示，分离细菌对链霉素、萘啶酸、强力霉素、美洛西林、诺氟沙星、痢特灵、庆大霉素、复方新诺明、罗美沙星、卡那霉素、多粘菌素B、左氧氟沙星、丁胺卡那霉素、氯霉素、头孢曲松钠的耐药率分别为100.00%、100.00%、60.00%、60.00%、53.33%、40.00%、40.00%、40.00%、33.33%、33.33%、26.67%、26.67%、20.00%、20.00%、6.67%。

3 讨论

3.1 根据送检病料的的临床检查和病理剖检情况，分离菌株的培养特性、形态结构、生化特性以及应用16S rDNA基因测序法快速鉴定分离菌株显示15株为沙门菌。血清型鉴定结果为7株鼠伤寒沙门菌，5株伤寒沙门菌，2株肠炎沙门菌和1株鸡白痢沙门菌。除了具备沙门菌的基本生化特点之外，7株鼠伤寒沙门菌均发酵麦芽糖和产硫化氢；然而5株伤寒沙门菌仅1株发酵麦芽糖，均不产硫化氢；此外，其中1株分离自鸡的鼠伤寒沙门菌能发酵蔗糖，蔗糖生化试验阳性率极低，对我国19729株沙门菌进行调查发现其仅为0.04%[5]。本试验的临床分离菌株中，鼠伤寒沙门菌和伤寒沙门菌为主要血清型。鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌属于泛嗜性沙门菌，感染的宿主范围广，能引起各种动物的沙门菌感染，也是引起人类食物中毒的主要病原之一。鸡白痢沙门菌可以感染各种年龄鸡，以雏鸡为主。目前，鸡白痢的流行呈世界性分布，各地常有流行，该病的传播主要是通过病禽和带菌禽，也可经过种蛋垂直传播。

3.2 本试验主要对分离株进行了15种药物的耐药性试验，分离菌株对链霉素、萘啶酸、强力霉素、诺氟沙星、美洛西林的耐药性较强，对链霉素和萘啶酸耐药率高达100%，根据送检病例用药调查可知养殖户在饲养过程中较多地使用了喹诺酮类和氨基糖苷类药物，研究结果进一步映证了分离株对喹诺酮类和氨基糖苷类等药物耐药率较高。对于没有用过的药物，如头孢曲松钠、丁胺卡那霉素等耐药率则很低或均敏感，说明耐药菌株的出现与长期使用该类药物有一定的相关性，建议临床上对沙门菌的治疗不用此类药物。沙门菌的耐药性具有较复杂的特征，且耐药程度有逐年上升的趋势[7]，因而在临床上对于禽源沙门菌的防治要做好预防措施，合理使用药物，结合药敏试验结果选择高敏药物，并且做好定期更换药物、配合用药，降低其对各类药物的耐药性，从而能对沙门菌进行有效的防治。

[1]Saif Y M.禽病学[M].11版.苏敬良，高 福，索 勋，译.北京:中国农业出版社，2005：637-692.

[2]Adzitey F，Rusul G，Huda N.Prevalence and antibiotic resistance of Salmonella serovars in ducks,duck rearing and processing environments in Penang,Malaysia[J].Food Res Int，2012，45(2):947-952.

[3]李婷婷.美国再次爆发活禽引发的沙门氏菌疫情[J].中国禽业导刊，2012，29（15）：57.

[4]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0[J].Molecular Biology and Evolution[J].2007.10.1093/molbev/msm092，2007，24（8）：1596-1599.

[5]朱超，许学斌．沙门菌血清型诊断［M］.上海:同济大学出版社，2009:16-17．

[6]潘渭涓，陈祥，王晓泉，等.1993-2008年禽源大肠杆菌和沙门菌对喹诺酮类药物耐药性分析[J].中国人兽共患病学报，2009，25（7）：630-635.