江苏人群MICA 基因多态性与乙型肝炎源性肝癌的相关性研究

苗祥宇，徐丽，刘红，张硕伟，吴情（江苏省宿迁市人民医院感染科 223800）

全球范围内原发性肝细胞癌（HCC）发病率位居恶性肿瘤第5位，约55%的病例发生在国内［1］。多项研究已证实慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致HCC 的重要原因之一，约有10%～25%HBV 感染患者最终发展为HCC［2］。在国内，90%以上HCC患者伴有HBV 感染［3］。近年来，越来越多的证据显示，单核苷酸多态性（SNP）与肿瘤的遗传易感性相关［4］。主要组织相容性复合体（MHC）－Ⅰ类链相关基因A（MICA）编码一种应激诱导性配体，主要与自然杀伤细胞（NK 细胞）活化型受体NKG2D 特异性结合，在NK 细胞活化和免疫监视中发挥作用。研究发现，MICA 多态性与恶性肿瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病等的易感性有密切关系。本研究旨在探讨MICA 基因多态性以及血清中可溶性MICA 抗原含量与乙型肝炎源性HCC的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料将2009年9月至2013年6月本院收治并经病理确诊的HCC患者161例纳入患者组，所有患者均为首次发病入院，未经过放射、化学治疗的患者；其中男131例，女30例，患者年龄22～80岁，平均（47.2±12.5）岁；所有患者乙型肝炎表面抗原（HBsAg）均为阳性。将同期无血缘关系、在本院体检健康者162例纳入健康对照组，其中男130例，女32例；年龄24～74岁，平均（45.6±11.8）岁。两组受试者性别、年龄等一般资料比较，比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取基因组DNA 提取采用Wizard基因组DNA 纯化试剂盒（美国Promega公司），操作严格按照说明书进行。分光光度计分析DNA 浓度和纯度，将浓度调整为50ng／μL。

1.2.2 基因分型运用聚合酶链式反应（PCR）产物直接测序法对MICA 基因多态性位点rs2596542进行基因分型。引物序列为：上游5′－TCG TCT CCC AAA GAA CAG CTA C－3′，下游5′－CCA GTC TCT GGA GTC ACT GTC－3′。PCR 总反应体系为25μL，含DNA 模板1μL，2×PCR mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA 聚合酶0.5μL，去离子水9μL。PCR 预变性94℃5min，变性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃30s，35个循环，72℃延伸7min。PCR 扩增产物片段为492bp。

1.2.3 血清MICA 水平检测采用酶联免疫吸附法（ELISA）、人MICA 检测试剂盒（美国Sigma－Ald rich公司），操作按照说明书进行操作。所有样品均设3个复孔，设置酶标仪波长450nm，读取吸光度值，根据MICA 标准品检测结果绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.3 统计学处理采用SPSS13.0软件对数据进行处理及统计学分析，计量资料采用表示，组间比较采用t检验；计数资料采用百分率表示，组间比较采用卡方检验。Logistic回归分析法计算比值比（OR）及95%置信区间（95%CI），以α＝0.05为检验水准，P＜0.05为比较差异有统计学意义。

2 结果

2.1 既往史与家族史比较患者组中有吸烟史、饮酒史、HCC家族史者明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 患者组和健康对照组的既往史与家族史比较（n）

2.2 MICA 基因多态性与HCC风险经Hardy－Weinberg平衡检验，健康对照组和患者组MICA 基因位点rs2596542基因型实际值与预测值比较，均符合Hardy－Weinberg 平衡（χ2＝2.344，P＝0.125和χ2＝3.420，P＝0.064）。患者组中GG 基因型的分布频率为23.6%，明显高于健康对照组的16.0%，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。进一步分析发现，GG 基因型携带者HCC 发病风险是AA 基因型携带者的1.860倍（OR＝1.860，95%CI：1.009～3.428）。携带G 等位基因者HCC 发病风险高于A 等位基因携带者（OR＝1.412，95%CI：1.030～1.936）。

表2 rs2596542基因型在患者组与健康对照组的分布［n（%）或n］

2.3 MICA 基因多态性与血清MICA 水平本研究采用ELISA 方法对HCC患者和健康体检者血清MICA 水平进行检测，发现患者组MICA 水平为（55.1±21.3）pg／mL，明显高于健康对照组的（9.7±4.3）pg／mL，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步分析MICA 基因多态性与血清MICA 水平的关系，结果显示，GG 基因型患者血清MICA 水平为（89.1±41.7）pg／mL，明显高于AA 基因型的（18.2±9.5）pg／mL和AG 基因型的（35.8±17.4）pg／mL，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

MICA 基因是MIC基因家族的成员之一。MICA 是功能基因，在人体正常组织细胞表达量极低［5］。研究发现，MICA基因在大多数上皮来源的原发性肿瘤，如肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等细胞上表达，被认为与恶性转化有关［6］。NK 细胞活化受体NKG2D 可以识别表达在肿瘤细胞表面的MICA／B。这些识别无须抗原处理和递呈，并且无MHC 限制性。MICA／B与NKG2D 结合刺激NK 细胞的活化。膜MICA 可上调效应细胞NKG2D 的表达，而膜MICA 可被基质金属蛋白酶水解释放入血液。可溶性MICA 的释放不仅降低肿瘤细胞表面MICA 的表达，降低肿瘤的免疫原性，也能影响免疫效应细胞表面NKG2D 的表达，进而影响NK 细胞和细胞毒性T 淋巴细胞（CTL细胞）抗肿瘤效应的发挥。张彩等［7］的研究也表明，可溶性MICA 通过降低NKG2D 的表达下调机体的抗肿瘤免疫效应。上述研究表明，NKG2D－MICA 的相互作用可有效调节NK 细胞和CTL细胞的杀肿瘤作用。本研究发现，乙型肝炎源性HCC 患者血清MICA 水平明显高于健康对照组（P＜0.05），说明可溶性MICA 在肝癌发生中发挥重要作用，这种作用与肿瘤免疫逃逸作用机制有关。

人类MHC基因域位于6号染色体短臂，共含有224个基因座，包含MIC家族7个成员的编码基因，其中MICA 位于经典MHC－Ⅰ类基因域着丝粒的末端，具有6个外显子，由5个内含子隔开［8］。Kumar等［9］发现MICA 上游4.7kb的变异位点与丙型肝炎病毒引起的HCC 相关。Paulisally等［10］研究了MICA 基因多态性与丙型肝炎源性肝癌的关系，发现SNP rs2596538与丙型肝炎源性肝癌易感性相关。有研究发现，另一个MICA SNP位点rs2596542与乙型肝炎源性HCC 易感性相关，G 等位基因携带者HCC发病风险明显大于A 等位基因携带者［11］。本研究结果与Kumar等［9］的研究类似，GG 基因型携带者比AA 基因型携带者乙型肝炎源性HCC发病风险高；或至少携带1个G 等位基因者比携带A 等位基因者更易患乙型肝炎源性HCC。SNP rs2596538G 等位基因携带者血清MICA 水平高于A 等位基因携带者，rs2596542G 等位基因携带者高于A 等位基因的携带者。本研究也发现，GG 基因型HCC患者血清MICA 水平明显高于AA 基因型和AG 基因型患者（P＜0.05）。回归分析结果显示，GG 基因型携带者比AA 基因型携带者乙型肝炎源性HCC发病风险要高。上述研究结果表明，MICA 基因多态性可能通过提高可溶性MICA 水平，从而影响HCC易感性。

综上所述，随着分子生物学、细胞生物学和人类基因组学、蛋白质组学等基础学科向癌症研究领域的延伸，HCC 分子诊断方法取得了长足的进展［12］。MICA 基因多态性和血清MICA 有可能成为乙型肝炎源性HCC 的生物学标记。其在临床诊断中的作用有待进一步研究。

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