MMP-1基因多态性与舌癌发生及预后的相关研究

刘建伟，马鹏飞

(赤峰学院附属医院口腔颌面外科，赤峰 024000;*通讯作者，E-mail:mapengfei365@126.com)

近些年口腔肿瘤已成为危害人类健康的主要疾病之一。2011年，在美国接近37 000例患者被诊断为口腔肿瘤，有66%的患者在诊断时已达晚期，致每年约有8 000例患者死于口腔肿瘤。口腔肿瘤的死亡率高于宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌及内分泌系统肿瘤［1］。舌癌是一种较常见的口腔肿瘤，其发病率逐年上升。恶性肿瘤具有浸润正常组织、向远处转移的能力，是影响肿瘤发病率、死亡率的重要因素［2］。细胞外基质不仅有组织支撑作用，对细胞的迁移也有一定的屏障作用，其降解依赖于多种酶，包括基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinase MMPs)。近年来研究发现MMPs通过改变细胞外基质、调节生长因子的活性、促进血管发生而参与肿瘤的生长［3］，其中基质金属蛋白酶1(MMP-1)已报道通过分解Ⅰ型胶原参与肿瘤的侵袭和转移，在进展性肿瘤MMP-1的表达与肿瘤生存率呈显著的正相关［4］。

位于 MMP-1基因启动子区域－1607 bp的MMP-1 1G/2G的单核苷酸多态性影响MMP-1的转录子水平，与肺癌、卵巢癌、结直肠癌及头颈肿瘤等疾病进展的风险呈强烈的正相关［5］，但国内尚无MMP-1－1607 1G/2G多态性与舌癌之间关系的研究。本研究以中国北方汉族为研究人群，采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性PCR-RFLP分析方法检测MMP-1基因－1607 1G/2G多态性位点，探讨MMP-1－1607 1G/2G多态性与舌癌的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2010－01～2012－01在赤峰学院附属医院就诊且病理学诊断为舌癌的患者共98例，其中男性41例、女性57例，平均年龄为(42.5±7.8)岁，均为初诊患者。应用UICC/AJCC(1997)TNM分期标准对舌癌进行分期，最长随访时间为20个月。

选择2010－01～2012－01在本院就诊的与病例组年龄、性别匹配的100例健康者(健康者定义为在研究期间未有任何疾病确诊)为对照组，平均年龄为(44.6±5.4)岁。

本研究经赤峰学院附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均签属知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本的收集及处理 抽取入选研究对象外周静脉血2 ml于EDTA抗凝管中，使用TIANGEN血液基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA。使用Thermo NanoDrop 2000紫外可见分光光度计检测DNA浓度，将DNA浓度稀释至20 ng/μl，－20℃保存。

1.2.2 包含MMP-1－1607 1G/2G片段扩增引物正向引物:5’－GCAAGTGTTCTTTGGTCTCT－3’，反向引物:5’－CTTTCTGCGTCAAGACTG－3’。片段长度为230 bp。

1.2.3 PCR扩增 PCR反应体系(25μl)包括:20 ng基因组 DNA、1×PCR buffer、0.2 mmol/L 脱氧核苷三磷酸、2 mmol/L MgCl2、50 pmol引物及 Ampli-Taq Gold DNA polymerase。扩增循环条件:95℃ 10 min预变性;95 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃9 s，共40 个循环;延伸72℃ 7 min。

1.2.4 位点检测 PCR扩增后，PCR产物用5个单位的FSPi限制内切酶37℃消化过夜，然后用2.5%的琼脂糖凝胶电脉确定基因型。经FSPi酶消化处理后可以产生150 bp和80 bp的片段，位点是G还是GG取决于FSPi酶能否发生作用。

1.3 质量控制

随机抽取10%的标本直接进行DNA测序，测序结果与PCR-RFLP结果100%一致。

1.4 Western blot测定 MMP-1

1.4.1 提取肿瘤组织总蛋白 术中留肿瘤组织迅速放入液氮中，用预冷的RIPA裂解液提取组织匀浆，冰浴静置 30 min，4℃ 12 000 r/min离心 30 min，吸取上层液体即为所提总蛋白。

1.4.2 蛋白浓度测定和变性蛋白 BCA蛋白试剂盒(美国Pierce公司)测定蛋白浓度。取50－100μg总蛋白，加2×SDS上样缓冲液，100℃变性5 min。

1.4.3 电泳 将各组样品蛋白和标准蛋白分子量Marker加样至配好的凝胶中，应用1×Tris－甘氨酸电泳缓冲液电泳(电压分别为:积层胶60 V，分离胶100 V)。

1.4.4 转膜与染色 将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜置于丽春红S液中染色5 min，观察蛋白转移到硝酸纤维素膜的效果;标出蛋白Marker的位置，之后去离子水漂洗至丽春红颜色褪去。

1.4.5 膜的封闭与杂交 用1×封闭液室温封闭1 h，MMP-1 抗体(abcam，ab52631)(1∶1 000 稀释)，4℃过夜后，用TBST(100 mmol/L Tris，1 500 mmol/L NaCl，调 pH 值至 7.6，并加 1%Tween－20)将硝酸纤维素膜清洗3遍，每次5 min;分别加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显影。结果以β－actin的蛋白表达为内参照，用AlphalmagerTM 2200凝胶图像分析系统，进行半定量分析。

1.5 统计学分析

使用SPSS 17.0软件统计分析。Hardy-Weinberg平衡检验判断纳入样本的代表性;基因型比较采用卡方检验;采用Logistic回归分析判断舌癌发生的风险，以比值比(OR)及95%可信区间(CI)表示相对危险度，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般特征

病例组98例，男性41例、女性57例，平均年龄为(42.5±7.8)岁;对照组 100例，男性 42例、女性58例，平均年龄为(44.6±5.4)岁;两组间性别、年龄无统计学差异(P＞0.05)。纳入本研究的98例患者中6例行局部扩大病灶切除+舌骨上清扫，45例行局部扩大病灶切除+肩胛舌骨上清扫，47例行局部扩大病灶切除+根治性颈淋巴结清扫。复发定义为局部复发和淋巴结转移，均经病理诊断证实。

2.2 基因分型及分布

MMP-1－1607 1G/2G基因型和等位基因频率分布见表1。病例组和对照组MMP-1－1607 1G/2G SNP位点基因型和等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律(病例组:χ2=3.294，P=0.070;对照组:χ2=2.054，P=0.152)，纳入对象具有良好的代表性。MMP-1－1607 1G/2G基因型分布在病例组和对照组中有显著差异(χ2=6.748，df=2，P=0.034)，病例组中携带等位基因与对照组无显著差异(χ2=1.538，df=1，P=0.215)。

表1 病例组与对照组MMP-1－1607 1G/2G基因型和等位基因频率分布 例(%)Table 1 Frequency distribution of MMP-1－1607 1G/2G genotypes and alleles in cases and controls cases(%)

2.3 MMP-1-1607 1G/2G基因型和等位基因与舌癌发生的风险

如表2表示，病例组和对照组携带1G/1G基因型与携带1G/2G基因型相比舌癌发生风险、没有显著差异(OR=0.493，95%CI 0.195－1.251;P=0.137)，携带2G/2G基因型较携带1G/1G基因型相比舌癌发生风险也无显著差异(OR=1.060，95%CI 0.420－2.678;P=0.901)。携带等位基因［1G］相比携带等位基因［2G］相比舌癌发生风险没有显著差异(OR=1.303，95%CI 0.857－1.980;P=0.215)。

表2 MMP-1-1607 1G/2G基因型和等位基因与舌癌发生相关性分析 (例)Table 2 Correlation of MMP-1-1607 1G/2G genotypes and alleles with the incidence of tongue cancer (cases)

2.4 MMP-1-1607 1G/2G基因型与舌癌预后的相关分析

在纳入的98例患者中，随防的20个月后，41例未复发，57例复发。基因型1G/2G和2G/2G较基因型1G/1G舌癌复发风险显著升高(OR=4.762，95%CI=1.106－20.501，P=0.036;OR=6.667，95%CI=1.619－27.456，P=0.009)。等位基因［2G］较等位基因［1G］舌癌复发风险显著升高(OR=2.397，95%CI=1.290－4.457，P=0.006，见表3)。

2.5 MMP-1-1607 1G/2G基因型与MMP-1表达的关系

我们用Western blot方法检测各组肿瘤组织MMP-1的表达情况，结果显示，1G/2G和2G/2G组MMP-1表达显著高于1G/1G组(见图1)。

表3 MMP-1-1607 1G/2G基因型与舌癌复发风险的关系 (例)Table 3 MMP-1-1607 1G/2G genotypes and alleles with the recurrent risk of tongue cancer (cases)

图1 三组肿瘤组织MMP-1的表达(Western blot)Figure 1 The expression of MMP-1 by western blot in the three groups of tumor tissues

3 讨论

本研究通过收集中国北方地区汉族舌癌患者及正常人外周静脉血标本，提取DNA、检测MMP-1基因－1607 1G/2G多态性位点，以探索MMP-1基因－1607 1G/2G多态性与舌癌的相关性。我们发现MMP-1基因－1607 1G/2G多态性与舌癌的发生无显著的相关性，但与舌癌的复发有相关性，结果提示携带2G等位基因舌癌复发风险高，且等位基因［2G］与MMP-1的表达呈正相关。

肿瘤的浸润和转移是多种因素参与的肿瘤细胞与机体复杂连续的相互作用的结果［6］，一些学者提出肿瘤细胞浸润和转移分三步，即黏附、降解和转移。在正常情况下，细胞外基质和细胞基底膜都受严格控制，在维持正常结构和生长进程中发挥着重要的作用。恶性肿瘤的形成、生长、浸润和转移都离不开细胞外基质和细胞基质膜中的基质金属蛋白酶家族MMPs的降解，这一过程是肿瘤细胞向周围组织转移的基础［7］。基质金属酶家族成员在肿瘤进展中发挥重要的作用，它们通过降解ECM组分而促进肿瘤的侵袭和转移［5］。近年来，越来越多的研究发现基质金属蛋白酶的底物延伸到许多非细胞外基质和膜结合蛋白，包括蛋白酶前体抑制剂、细胞因子、潜在的生长因子、生长因子结合蛋白和黏附因子等［4］。因此研究MMP-1及其基质金属酶家族其他成员如何促进肿瘤的转移，改变组织微环境中促进细胞转移的信号可能是治疗转移性癌症的关键。基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)也称间质胶原酶、成纤维细胞胶原酶，是由MMP-1基因编码合成的。MMP-1基因属于MMP家族，位于染色体11q22.3，通过分解Ⅰ型胶原参与肿瘤的侵袭和转移，在进展性肿瘤MMP-1的表达与肿瘤生存率呈显著的正相关［8－11］。MMP-1－1607位点位于距MMP-1基因启动子区域－1607 bp的位置，这个位点具有基因多态性，当一个鸟嘌呤插入时(即序列由5’GAT3’1G 变为5’GGAT3’2G)时，这个新的序列是Ets转录因子的中心序列，可以与1602 bp的刺激蛋白相结合，从而增强转录活性［12，13］。MMP-1－1607 1G/2G多态性在转录子的调节过程中起着重要的作用，与肿瘤的复发相关联。近年来发现2G等位基因的存在与MMP-1的表达呈正相关，且往往提示预后不良［14］。本研究中，通过收集中国北方地区汉族舌癌病例，进行MMP-1－1607 1G/2G单核苷酸多态性与舌癌发生风险及复发风险的相关分析，发现虽然MMP-1－1607 1G/2G基因型在病例组和对照组中无显著差异，但基因型1G/2G和2G/2G较基因型1G/1G舌癌复发风险显著升高。等位基因［2G］较等位基因［1G］舌癌复发风险显著升高(OR=2.397，95%CI=1.290－4.457，P=0.006)。基因型 1G/2G 和2G/2G 较基因型1G/1G MMP-1的表达增加。本研究发现等位基因［2G］可能提示舌癌的预后不良，对于评价舌癌的预后有重要意义，对于存在等位基因［2G］的患者行积极治疗，对降低舌癌的复发率具有重要意义。

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