姜黄素通过抑制NF-κB的活化增加胃癌细胞的放疗敏感性

吴 宏，闫国诚，王双全，王 凯，张 毅

(1西电集团医院普外科，西安 710007;2西安交通大学第一附属医院病理科;*通讯作者，E-mail:wuhongg666@163.com)

胃癌是普外科常见肿瘤之一，胃癌的治疗除手术治疗外，放射治疗也是重要的治疗方法之一，但由于放疗耐受的发生，其治疗效果一直不甚理想。开发新的放疗增敏剂，提高患者放射治疗的疗效，成为当下研究的热点之一。中药因其作用广泛、毒副作用较低，成为放疗增敏剂的重要选择方向之一，因此，许多研究将目光投到了中药领域，其中就包括姜黄素［1－3］。

姜黄素是姜黄根茎中的主要有效成分，其为一种多元酚。既往研究发现其对肿瘤细胞具有抗增殖、促凋亡、抗血管生成和诱导细胞周期阻滞等多种功能［4－11］。也有研究发现其具有放疗增敏作用［3］，但是其具体分子机制尚未明确。基于以上背景本实验选择观察姜黄素对胃癌细胞的放疗增敏作用，探讨其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

姜黄素购自美国Sigma公司，使用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成10 mmol/L的储存液备用。人胃癌细胞株(BGC-823)为本实验室保有，细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。兔抗人p65抗体，兔抗人p50抗体，兔抗人AKT抗体，兔抗人p-AKT抗体购自美国Cellsignal公司，抗β－actin抗体及羊抗人Histone H1购自美国Santa公司。

1.2 MTT实验检测姜黄素对胃癌细胞系BGC-823增殖的影响

利用MTT方法检测姜黄素对胃癌细胞系BGC-823增殖的影响。将细胞接种于96孔板中每孔接种细胞大约3×103个(细胞计数法)，培养过夜，次日吸去细胞培养基，用含有不同浓度姜黄素(0，10，20，30，40，50，60 μmol/L)的培养基对细胞进行培养，48 h后利用MTT法检测。根据每组细胞数占DMSO干预组个数百分比对比实验结果。

1.3 克隆形成实验检测姜黄素对胃癌细胞放疗敏感性的影响

将胃癌细胞系BGC-823分为两组，对照组利用DMSO进行处理，实验组利用25μmol/L的姜黄素进行处理。4 h后室温条件下接受照射(放射量分别为0，2，4，6 Gy)，然后吸弃细胞培养液，洗涤细胞两次，将细胞重悬后接种于60 mm培养皿，培养10－14 d后结晶紫染色后计数细胞克隆。

1.4 Western blot检测姜黄素对p65、p50、AKT 和p-AKT表达的影响

将胃癌细胞系BGC-823细胞分为三组0，25，50 μmol/L姜黄素干预组，每组都接受4 Gy的射线照射。处理方法同克隆形成实验。然后收集细胞按以下方法提取蛋白。

1.4.1 总蛋白提取 将1×106个单细胞悬液裂解于200μl细胞裂解液中，充分裂解后低温离心，上清即为细胞总蛋白。

1.4.2 胞核蛋白提取 方法参照试剂盒说明进行(南京凯基)，具体如下:取培养细胞5×106－1×107个/ml，4 ℃离心，500×g，3 min 后收集细胞，弃去培养液，用预冷PBS洗涤两遍;移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞压积PCV(离心后的紧实细胞体积);每20μl细胞压积中，加入200μl预冷的Buffer A，最大转速涡旋剧烈振荡15 s，置冰上10－15 min;加入11μl冷Buffer B，最大转速涡旋剧烈振荡5 s，置冰上1 min;再次最大转速涡旋剧烈振荡5 s后，4 ℃离心，16 000×g，5 min;尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞质蛋白;在离心沉淀物中加入100μl预冷的Buffer C，再次离心，即可得到胞核蛋白。蛋白采用BCA试剂盒进行定量。提取蛋白定量后每孔取50μg上样，其后进行凝胶电泳并转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗(抗 p65 抗体 1∶500，抗 p50 抗体 1∶600，抗 AKT抗体1∶1 000，抗p-AKT 抗体1∶1 000，β－actin抗体1∶1 000，抗Histone H1 抗体1∶1 000)4 ℃孵育过夜，相应二抗常温孵育2 h，加入发光液用上海培清凝胶酶谱成像仪检测蛋白表达量。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 姜黄素对胃癌细胞系BGC－823细胞增殖能力的影响

随着姜黄素作用浓度的增加，姜黄素对胃癌细胞系BGC-823细胞的增殖的抑制作用逐渐增强，其作用表现出明确的剂量效应关系，在浓度高于40 μmol/L时，这种作用更为强烈，与空白对照浓度比较，差异有统计学意义(见图1)。

图1 姜黄素对胃癌细胞株系BGC-823增殖能力的抑制作用Figure 1 The anti-proliferative effect of curcumin on gastric cell lines BGC-823

2.2 姜黄素处理后细胞的放疗敏感性明显增加

根据MTT的相关结果，我们选用25μmol/L作为姜黄素的干预剂量(对细胞的增殖没有明显的抑制作用)。实验细胞分为两组:空白对照组(0 μmol/L)和姜黄素干预组。实验结果发现，经姜黄素处理后，空白对照组细胞存活率随放射剂量的增加逐渐降低，而姜黄素干预组随放射剂量的增加细胞存活率降低更加明显，且两组比较差异显著(P＜0.05，见图2)，即经姜黄素处理后，照射后细胞克隆形成能力明显降低，且随着照射剂量的增加这种抑制作用更为明显。

2.3 姜黄素抑制胃癌细胞系BGC-823中AKT的磷酸化水平及NF-κB的核内表达水平

Western印迹法结果表明胃癌细胞系BGC-823细胞核内p65和p50的表达水平明显降低(见图3A)，利用Image J软件测量各组数据的灰度值并对数据进行处理后发现，差异具有统计学意义(见图3B)。这提示NF-κB在姜黄素干预后入核的量与空白对照组相比明显减低，姜黄素可能是通过抑制NF-κB的入核，从而阻断其对下游基因的表达的调控来发挥其在胃癌细胞自BGC-823中的作用的。

此外我们的研究还发现，与对照组相比，姜黄素干预后细胞内总的AKT没有变化，磷酸化的AKT明显减少，并随姜黄素浓度增加而减少(见图4A)。利用Image J软件测量各组数据的灰度值对各组p-AKT与AKT的比值占空白对照组百分比进行统计分析后发现，差异具有统计学意义(见图4B)，随姜黄素浓度增加，磷酸化AKT百分比逐渐降低，提示，姜黄素可以抑制AKT的磷酸化。

图2 姜黄素对放射治疗后细胞的存活率影响Figure 2 Effect of curcumin on post-radiation cell clonogenic survival of gastric cells

图3 照射后姜黄素抑制胃癌细胞系中p65和p50的核内表达水平Figure 3 Curcumin inhibited the expressions of p65 and p50 in the nucleus after irradition

图4 姜黄素对照射后胃癌细胞系中p-AKT和AKT表达水平的影响Figure 4 Effect of curcumin on the phosphorylation level of AKT after irradition

3 讨论

胃癌是普外科最为常见的肿瘤之一，世界范围内占所有肿瘤总数的8%，占肿瘤致死总数的10%［12］。除外科手术治疗之外，放射治疗是胃癌术后重要的治疗方法之一，但并不是所有的患者都对放射治疗敏感，部分患者甚至出现明显的耐受。临床迫切需要解决这一难题，放疗增敏剂的获得便是解决这一问题的重要途径之一，目前中药放射敏感性的研究较少，探索中药在此方面的作用具有重要意义，姜黄素便是其中之一。在临床应用中姜黄素因为具有价格低廉、可口服且低毒性的特点，成为大家关注的焦点。研究发现姜黄素在达到12 mg/d的剂量时，人体仍可良好耐受，无明显的毒副作用出现［13］。也有研究发现姜黄素对结肠癌具有预防作用且有效剂量较低［14，15］。本实验观察姜黄素对胃癌细胞系BGC-823的放疗增敏作用，结果发现姜黄素能够抑制胃癌细胞株BGC-823的增殖，在低于增殖抑制浓度的剂量具有明显的放疗增敏作用。

既往研究发现，NF-κB的活化与放射引起的细胞凋亡密切相关［16］。由于肿瘤细胞的凋亡与其放疗敏感性密切相关，许多研究致力于明确NF-κB的活化与放疗增敏的关系，多数研究认为NF-κB的活化确与放疗增敏密切相关，抑制NF-κB的活性能够明显提高肿瘤细胞对放疗的敏感性［17－21］。姜黄素作用范围广泛，其对肿瘤细胞的作用涉及到多种分子及信号通路，我们推测其作用机制可能与NF-κB的活性改变相关，所以本实验将其列为研究的指标之一。实验结果表明，姜黄素能够明显抑制NF-κB的p65和p50亚基的入核，提示姜黄素可能是通过抑制NF-κB的入核进一步作用下游靶基因，增强胃癌细胞系BGC-823的放疗敏感性。

AKT信号通路是细胞内最为常见的细胞信号通路之一，其对细胞增殖、凋亡及侵袭转移等均具有调节作用。此外研究发现AKT信号通路与肿瘤的放疗增敏密切相关［22］，也有研究显示，姜黄素对AKT信号通路的活性具有调节作用，姜黄素能够抑制细胞内AKT的磷酸化水平［23］。因此，我们推测姜黄素对胃癌细胞的放疗增敏作用可能与AKT信号通路相关。本研究证实，姜黄素可以明显抑制AKT信号通路的磷酸化水平。

综上，本研究发现姜黄素能够增强胃癌细胞系的放疗敏感性，而这种作用可能与其对NF-κB活性的抑制相关，而其对NF-κB活性的抑制可能与其对AKT的磷酸化水平的调节相关。本研究为姜黄素应用胃癌的增敏治疗提供了新的实验依据，为其在临床中的应用垫定了基础。

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