17β－雌二醇对离体大鼠冠状动脉张力的影响及其机制

崔丽娟，牛龙刚，刘 宇，梁月琴，牛拴成，陈晋原

(山西医科大学机能实验室，太原 030001)

绝经前妇女心血管疾病发病率明显低于同龄男性和绝经后妇女，说明雌激素具有很强的心血管保护作用［1－3］。动物研究表明，雌激素能够通过非基因组途径快速舒张血管，雌激素的快速舒血管作用可能是雌激素促进了血管内皮细胞释放NO，进而抑制平滑肌细胞的收缩［4］。有报道，雌激素可以直接抑制血管平滑肌细胞的收缩作用，产生舒血管作用［5］。然而，雌激素作用于血管的确切机制还未完全清楚。本实验采用离体血管环灌流的方法观察17β－雌二醇对内皮完整和去内皮大鼠冠状动脉环的急性舒张作用，并分析其机制。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

17β－雌二醇 、苯肾上腺素、乙酰胆碱、左旋硝精氨酸甲酯、亚甲蓝、四乙胺、格列本脲、(－)BayK8644、ICI182780均购自美国Sigma公司。

Multi Myograph System－610M Danish Myo Technology A/S(DMT):丹麦，DMT公司;Power Lab生物信号采集分析系统及张力换能器:澳大利亚，埃德仪器国际贸易有限公司;PHs－3C精密pH计:中国，上海雷磁仪器厂;Hss－1B数字式超级恒温泵:中国，成都仪器厂;Olympus SZX－ILLB200解剖显微镜:日本。

1.2 大鼠冠状动脉血管环标本的制备

SD大鼠，体重220－240 g，由山西医科大学实验动物中心提供。制备方法参照文献［6］，大鼠断头处死后，立即取出心脏，置于氧饱和的4℃ PSS液中，解剖显微镜下钝性分离冠状动脉，在前降支处剪取2mm的血管环。将分离干净的动脉环穿入两根直径为40μm的钨丝，将血管环固定在Multi Myograph System－610M(DMT)浴槽内的传感器上，持续通以100%O2。浴槽温度恒定在37℃，平衡60－90 min后开始实验。平衡期间每隔15－20 min用37℃的PSS液更换一次浴槽内液体。血管环的张力变化通过DMT的换能系统采集，并通过Chart5.5记录在计算机上。在开始正式实验之前，用60 mmol/L的KCl预收缩，当收缩达稳定的平台时用ACh(10－6mol/L)舒张，连续3次，当相邻两次刺激的收缩幅度或舒张幅度差别不大于10%时，认为血管环组织结构完整，功能正常，再稳定30 min，然后开始正式实验。

1.3 离体血管环实验

①为研究不同浓度17β－雌二醇舒张大鼠离体冠状动脉的作用与内皮的关系，将实验分为内皮完整组和去内皮组;②为研究此舒血管作用与一氧化氮合酶/一氧化氮/环磷酸鸟苷通路的关系，将实验分为左旋硝精氨酸甲酯组(10－5mol/L)和亚甲蓝组(10－5mol/L);③为研究此舒血管作用与钾通道、钙通道及雌激素受体的关系，将实验分为钙激活钾通道(KCa)阻断剂四乙胺(10－4mol/L)组、ATP敏感钾通道(KATP)的阻断剂格列本脲(10－5mol/L)组、L－型钙通道激动剂(－)BayK8644(10－6mol/L)组及雌激素受体阻断剂ICI182780(10－6mol/L)组。以苯肾上腺素诱发的最大收缩度为标准值100%，各种药物对血管环最大舒张率为加药后与加药前收缩幅度的百分比。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 17β－雌二醇对大鼠冠状动脉环的作用

如图1 所示，17β－ 雌二醇(10－10－10－5mol/L)可引起内皮完整的苯肾上腺素收缩的冠状动脉剂量依赖性的舒张效应，去内皮后，其舒血管效应减弱。其中10－6和10－5mol/L两个浓度组的舒张效应明显低于同浓度内皮完整组(P＜0.05)。

图1 17β－雌二醇对大鼠冠状动脉环舒张的量效关系(x¯±s，n=6)Figure 1 Concentration-relaxation curves of 17β-estradiol on precontraction induced by phenylephrine(10－6 mol/L)in rat isolated coronary artery rings(x¯±s，n=6)

2.2 一氧化氮合酶/一氧化氮/环磷酸鸟苷通路对17β－雌二醇所致大鼠冠状动脉环舒张作用的影响

实验分别观察10－5mol/L的左旋硝氨酸甲酯(L-NAME)和亚甲蓝对10－7－10－5mol/L 17β－ 雌二醇对冠状动脉环舒张作用的影响，结果表明左旋硝精氨酸甲酯和亚甲蓝均可抑制10－6mol/L和10－5mol/L 17β－雌二醇的作用，使两组冠状动脉环的最大舒张率显著降低(P＜0.05，见图2)。

2.3 钾通道、钙通道及雌激素受体对17β－雌二醇所致大鼠冠状动脉环舒张作用的影响

如图3所示，四乙胺、格列本脲、(－)BayK8644可以减弱17β－雌二醇的舒张血管作用(P＜0.05)。在17β－雌二醇的浓度为10－6mol/L时，最大舒张率分别降低为(6.74±1.61)%，(21.22±6.31)% 和(15.16±8.43)%，其中四乙胺的作用更显著。雌激素受体特异性阻断剂ICI182780对同浓度17β－雌二醇的舒张作用无明显影响(P＞0.05)。

图2 L-NAME和亚甲蓝对17β－雌二醇所致大鼠冠状动脉环舒张作用的影响(x¯±s，n=6)Figure 2 Effects of L-NAME and methylene blue on 17βestradiol-induced vasorelaxation induced by PE(10－6 mol/L)in rat isolated coronary artery rings(x¯±s，n=6)

图3 不同通道及受体对17β－雌二醇所致大鼠冠状动脉环舒张作用的影响(±s，n=6)。Figure 3 Effects of TEA，Gli，(－ )BayK8644 and ICI182780 on 17β-estradiol-induced vasorelaxation induced by PE in rat isolated coronary artery rings

3 讨论

心血管系统也分布有雌激素受体，因而其功能也受雌激素影响。流行病学、动物实验及人类的大量资料表明雌激素对心血管系统的功能有保护作用［7］。本文观察了17β－雌二醇血管舒张作用，并初步探讨了其作用途径。

文献资料报道［8］，17β－雌二醇的急性舒张血管作用为血管内皮依赖性和血管内皮非依赖性，NO在此作用中起关键作用。本实验发现17β－雌二醇(10－10－10－5mol/L)可引起急性浓度依赖性的冠状动脉环舒张;去内皮后，17β－雌二醇的舒张血管作用减弱，10－6和10－5mol/L两浓度组的舒张效应明显低于内皮完整组。提示17β－雌二醇的舒张血管作用为部分内皮依赖性。

自从1980年Furchgott等［9］发现内皮细胞释放内皮衍生性舒张因子(endothelium-derived relaxing factor，EDRF)以来，血管内皮细胞在调节血管舒缩方面的作用引起极大关注。即血管内皮细胞分泌一氧化氮，一氧化氮以旁分泌的形式作用于血管下平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶，使细胞内环磷酸鸟苷浓度升高，舒张血管。本实验发现，一氧化氮合酶抑制剂左旋硝精氨酸甲酯和鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲兰均可以抑制高浓度17β－雌二醇(10－6mol/L和10－5mol/L)的血管舒张作用。提示血管内皮分泌的NO参与了17β－雌二醇的急性舒血管作用。

作为调节平滑肌细胞膜电位的主要因素，钾通道的活性是决定血管张力的一个重要因素。钾通道开放，钾离子外流，细胞膜超极化，血管平滑肌张力下降，血管舒张［10］。本实验发现，17β－雌二醇诱导的舒张血管作用可以被KCa阻断药四乙胺和KATP阻断药格列本脲抑制，表明KCa和KATP参与了其舒血管作用。(－)BayK8644是电压依赖性钙通道L－型钙通道的激动剂，17β－雌二醇对冠状动脉环的舒张作用可以被(－)BayK8644所抑制，进一步提示17β－雌二醇的舒张血管作用也可能通过开放血管平滑肌细胞膜钾通道→钾外流增加→细胞膜超极化→抑制电压依赖性钙通道→钙内流减少→细胞内钙浓度降低→平滑肌舒张这一途径而实现。

雌激素受体特异性的阻断剂ICI182780对17β-雌二醇的舒张作用无明显影响，提示雌激素受体可能没有参与17β-雌二醇的舒张血管作用。本文得出以下结论:①17β-雌二醇可引起内皮依赖性的冠状动脉环舒张;②一氧化氮合酶/一氧化氮/环磷酸鸟苷通路参与了17β-雌二醇所致大鼠冠状动脉环舒张作用;③17β-雌二醇的冠状动脉环舒张作用与钾通道(KCa和KATP)开放，钾外流增加和阻断钙通道，抑制钙内流有关;④此作用与雌激素受体无关。

［1］Stampfer MJ，Coldita GA，Willett WC，etal.Postmenopausal estrogen therapy and cardiovascular disease.Ten year follow up from the nurses health study［J］.N Engl J Med，1991，325:756－762.

［2］Matori H，Umar S，Nadadur RD，etal.Genistein，a soy phytoestroogen，reverses severe pulmonary hypertension and prevents right heart failure in rat［J］.Hypertension，2012，60(2):425－430.

［3］Lancaster TS，Jefferson SJ，Korzick DH.Local delivery of a PKCepsilon-activating peptide limits ischemia reperfusion injury in the aged female rat heart［J］.Am J Physiol Eegul Integr Comp Physiol，2011，301(5):R1242－1249.

［4］Cruz MN，Douglas G，Gustafsson JA，etal.Dilatory responses to estrogenic compounds in small femoral arteries of male and female estrogen receptor beta knockout mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290(2):H823－829.

［5］Leung HS，Seto SW，Kwan YW，etal.Endothelium independent relaxation to raloxifene in porcine coronary artery［J］.Eur JPharmacol，2007，555(2/3):178－184.

［6］Niu LG，Zhang MS，Liu Y，etal.Vasorelaxant effects of taurine is diminished by tetraethylammonium in rat isolated arteries［J］.Eur J Pharm Pharmacol，2008，580:169－174.

［7］Grady D.Cardiovascular disease outcomes during 6.8 years of hormone therapy for heart and estrogen/progestin replacement study follow up(HERS Ⅱ)［J］.JAMA，2002，288:49－57.

［8］DubeyRK，Oparil S，Imthurn B，etal.Sex hormones and hypertension［J］.Cardiovasc Res，2002，53(3):688－708.

［9］Furchgott RF，Zawadski JV.The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine［J］.Nature，1980，288:373－376.

［10］Nelson MT，Ferrige AG，Moncada S.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor［J］.Nature，1987，327(6122):524－526.