不同时间注射PMSG和HCG对小鼠超排卵效果的影响

陈喜英，郭永昌，刘田福

(山西医科大学实验动物中心，太原 030001;*通讯作者，E-mail:13603518575@163.com)

近年来，随着转基因技术的迅速发展和成熟，转基因动物在生物医药、生命科学研究领域得到越来越广泛的应用。国际上报道了多种得到转基因动物的方法，目前真正成熟并可以稳定得到转基因动物的方法主要有三种，即原核显微注射法、精子介导的基因转移法和核移植。其中，显微注射法是转基因最简单、最常用的的方法，其操作步骤包括受精卵的采集、显微注射和胚胎移植。要取得原核显微注射的高成功率首先要得到质量好、数量多的原核期受精卵。小鼠在生理状态下一次排卵10－15颗，远不能满足实验的需要。为了增加可获得的卵子数量，用孕马血清(PMSG)模拟促卵泡激素，用人绒毛膜促性腺激素(HCG)模拟黄体生成素(LH)可以诱发交配雌鼠排卵多于正常排卵数即超排卵。超排反应是一个由一系列极其复杂的生理过程累积而产生的结果，影响因素诸多［1］，包括动物遗传特性、体况、营养状态、年龄、发情周期的阶段、卵巢的功能状态、季节、温度以及激素剂量等。已有多个实验室对超排反应的条件进行了摸索［2－5］。受精卵的数量和质量主要取决于促性腺激素的注射时间及用量，小鼠品系、鼠龄及体重等。为了进一步探讨有效的小鼠超排卵方法，我们在控制其他条件一致的情况下，对给予激素的时间做了实验分析，以求找到一个最适宜的注射时间，能得到最大数量及最好质量的可用于显微注射的受精卵。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级昆明系白小鼠雌雄各40只，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(晋2009－0001);雌鼠作为供体鼠，5周龄，体重20－25 g;雄鼠8周龄，体重35 g左右。动物房饲养环境温度20－24℃，相对湿度50%－55%，光照周期7:30－19:30，正常饲料及饮水。

1.2 主要试剂与器材

M2培养液，M16培养液，透明质酸酶，矿物油均购自美国 Sigma公司，孕母马血清(PMSG)，人绒毛膜促性腺激素(HCG)均购自宁波激素制药厂;体视显微镜(Motic)、毛细玻璃管(NarisHige)、精细镊子(Dumont)等各种手术器械。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组、给药 40只雌性小鼠编号，随机分为4组，经检验组间差异不显著，4组编号为1，2，3，4。按试验方案给药，分别与雄鼠合笼，检栓。

1.3.2 实验方案 第1天:11:00，13:00，15:00，17:00分别给1，2，3，4组雌鼠腹腔注射PMSG 5 IU。

第3天:11:00，13:00，15:00，17:00 分别给 1，2，3，4组雌鼠腹腔注射HCG 5 IU，然后立即与雄鼠合笼(雌雄比例为1∶1)。

第4天:于8:00检查所有雌鼠阴栓，记录见栓小鼠编号和数目。

1.3.3 获取受精卵 依组别脱臼处死见栓小鼠，75%酒精体表消毒后开腹;缓慢牵拉子宫暴露输卵管，剪下输卵管，将其置于M2液滴中，于镜下撕破膨大壶腹部，释放出受精卵。经300μg/ml的透明质酸酶消化后计算每只小鼠受精卵数量。

1.3.4 胚胎体外培养 将洗好的受精卵转移至平衡好的M16液滴中，置于37℃，5%CO2孵箱中培养过夜，第2天计算每只小鼠获得二细胞胚胎数。

1.4 统计学分析

2 结果

四组小鼠在不同时间注射PMSG和HCG发生超排反应后获得的胚胎数，具体结果见表1。

表1 不同激素注射时间对小鼠超排效果的影响(±s)Table 1 Effect of the different administration time of PMSG，HCG on the superovulation in mouse(±s)

表1 不同激素注射时间对小鼠超排效果的影响(±s)Table 1 Effect of the different administration time of PMSG，HCG on the superovulation in mouse(±s)

与其余各组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

2 13∶00 10 9 90* 256 25.60±2.731* 248 24.80±1.737 3 15∶00 10 5 50 138 13.80±1.868 115 11.50±3.277 4 17∶00 10 2 20 66 6.60±1.490 47 4.70±2.736

由表1可以看出，第2组(11:00组)平均获胚胎数和Ⅱ－细胞胚胎数均为最高，分别为25.6和24.8，而第4组(17:00组)平均获胚胎数和2－细胞胚胎数均为最低，分别为6.6和4.7。

经F检验得，四组间超排效果差异显著，其中第2组与第1，3，4组间均存在统计学差异(P＜0.01)。

3 讨论

小鼠的超排卵是科学研究中得到卵母细胞和胚胎的常规方法。有报道认为5 IU PMSG+5 IU HCG剂量组合对小鼠超排效果最好［6，7］。当PMSG剂量过低时，不能有效促进较多卵母细胞同时发育，也就达不到超排效果;相反，激素剂量过大则会引起卵巢“过刺激”而使卵母细胞的排放率降低，产生抑制作用。

PMSG与HCG间有着相互影响，且也与动物房的明暗周期有关，所以他们的注射时间会影响到排卵的数目及发育的一致性。目前，小鼠超数排卵第一次注射激素采用的时间并不统一［8－10］，超排数量获卵数一般为20－30枚。小鼠的发情受环境影响，尤其是光照控制，在稳定的光控条件下，排卵一般发生在黑暗后的3－5 h［11］。本试验所用小鼠在自然光照暗循环为19∶30至7∶30条件下饲养，动物房明暗循环条件能影响外源激素刺激内源激素的释放［12］。在相同暗循环条件下，激素不同注射时间对小鼠超排有一定影响，HCG应在内源性的LH释放之前腹腔注射［13］。而内源性LH的释放是在PMSG的刺激下由明暗周期控制的。我们比较了不同时间注射PMSG及HCG，发现在第1天13∶00注射5 IU的PMSG，48 h后注射5 IU HCG，第4天早上收集卵，获得的受精卵正常发育成二细胞最多。这样可以保证HCG至少比内源性的LH早2－3 h进入体内。

以不同起始时间超排小鼠，其排卵、受精及早期胚胎发育时程具有规律性，但本实验结果表明，在4个不同起始时间超排小鼠所得的排卵数呈现出不同程度的差异。其中原因为，所挑选小鼠的发情周期阶段均为发情前期，发情前期持续的时间为17－24 h［2］，部分实验小鼠处于发情前期早期，部分已经处于发情前期末期，处于发情前期不同阶段的小鼠，其卵巢卵泡的发育状况各不相同，导致了其在超排激素作用后的排卵时间有所差异，从而影响了随后的受精及胚胎发育时程。其次，小鼠本身存在个体差异，对超排激素刺激的反应和对激素的耐受能力不同，导致促性腺激素对个体作用效果不同，从而出现个体之间排卵、受精和胚胎发育时间不一致，在同一个体也存在排卵时间不整齐、受精时间不一致甚至胚胎发育时程并非同步进行的现象，卵母细胞及早期胚胎的数量也有所差别。在一定程度上也会对小鼠排卵、受精及胚胎发育时程整体的规律性造成影响。但主要原因还是与小鼠自然状态下发情与交配的生理周期相关。

以13:00为起始时间超排小鼠，其胚胎发育时程趋势规律性最显著，这与小鼠自然发情的生理特性相关。在注射 PMSG 48 h后，卵巢卵泡受到PMSG的刺激，大部分已发育成为排卵前卵泡，此时给予HCG注射，可进一步促进卵泡排卵。所以以13:00为起始时间超排，其超排效果较为理想，排卵、受精、胚胎发育规律性最为显著。

超排是一个极为复杂的过程，影响因素很多，主要有实验动物的品系、激素剂量、PMSG和HCG注射的间隔时间以及动物的年龄和生殖健康状态等［14－17］。本文仅就激素注射时间进行探讨，说明激素的注射时间对超排有明显影响。其他因素，如激素的生物活性，动物的某些因素如小鼠的品系，周龄，体重及内分泌活动对超排效果也将产生更直接的影响，今后还有待进一步研究。

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