响应曲面法优化喜树碱的超声提取工艺

康大力，沈小钟，张洪利＊（.广东食品药品职业学院，广州 5050；.广东省中药研究所，广州 5050）

喜树（Camptotheca acuminata）为珙桐科喜树属植物，为我国南方特有品种。1966年，Wall等［1］首次从喜树中提取并鉴定出具有抗肿瘤活性的生物碱成分喜树碱（camptothecin），并于20世纪70年代开始了喜树碱的临床研究。迄今为止，喜树碱类抗癌药物仍是唯一一类上市的拓扑异构酶Ⅰ阻断剂。irinotecan和topotecan这2种喜树碱衍生物已被批准上市用于多种癌症的治疗［2］。目前，喜树碱衍生物的获得主要从喜树原植物中直接分离提取或由喜树碱进行结构修饰得到。

由于天然材料中化学成分复杂，次生代谢产物的含量较低，因此，必须优选简便、高收率的提取方法，并建立快速、准确、灵敏的检测方法，以满足次生代谢产物研究的需要。近年来，超声提取逐渐成为新兴起的一种提取方法，超声波具有空化、搅拌、粉碎等作用，可以破坏细胞壁，使溶剂进入到细胞中充分溶解有效成分，与传统提取方法比，具有时间短、操作简便、不需要加热等特点［3］。本文采用响应曲面设计实验优化喜树碱的提取方法，通过对响应面的分析优选最佳工艺，利用其直观、高效、简便等特点［4－6］，考察温度、时间、料液比等因素对喜树碱提取率的影响，为喜树碱及其衍生物生产提供研究基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱系统（Waters公司，美国），配备DAD检测器，色谱柱为C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex 110A）。

1.2 试药 药材采集于广东省中药研究所中药标本园，经成都中医药大学峨嵋学院刘晓春副教授鉴定为珙桐科喜树属植物喜树（Camptotheca acuminata Decne.）的果实；用自来水洗净，室温下阴干，粉碎，于45℃烘干至恒质量；乙腈（色谱纯，天津市协和昊鹏色谱科技有限公司，批号：090810）；喜树碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号100532－200401）。

2 方法与结果

2.1 响应曲面法设计喜树碱的提取工艺 利用Design－Expert软件设计响应曲面实验，采用体积分数60%的乙醇为提取溶剂，以提取温度、提取时间、料液比3个因素为自变量，以喜树果实粉末为材料，超声提取为基本方法，喜树碱的得率为响应值，设计响应面分析实验，包括析因实验和中心实验共17次，因素水平分析选取［7］，见表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

2.2 喜树碱含量测定 色谱条件：使用梯度流动相（0～15min，25%乙腈线性升高到50%乙腈，梯度洗脱；15～18min，等度洗脱；18～19min，50%乙腈线性降至25%乙腈；19～20min，等度洗脱），流速1.0mL·min－1，柱温为30℃，进样量10μL。

对照品溶液的制备：取喜树碱对照品，精密称定，采用甲醇溶解制成质量浓度为1mg·mL－1的储备液，用时分别取0.5，1.0，2.0，4.0和8.0mL的储备液，用甲醇定容10mL，摇匀，配成一系列不同质量浓度的对照品溶液。

供试品溶液的制备：称取2.0g喜树果实粉末，装入250mL锥形瓶中，按照表1的因素水平表进行实验，提取液经滤纸过滤，水浴挥干溶剂，用甲醇溶解、定容至10mL，0.22μm 微孔滤膜过滤，进HPLC分析仪定量分析。

2.3 响应曲面分析结果 按照表1进行响应曲面分析实验，用体积分数60%乙醇超声提取喜树果实喜树碱，响应曲面实验方案与结果见表2。统计分析结果见表3。

对表2中的数据采用Design Expert软件拟和得到提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）与喜树碱得率之间的二次多项回归方程：

喜树碱得率（%）＝00.45＋1.850×10－3A ＋2.862×10－3B－7.125×10－4C－6.500×10－4AB－9.500×10－4AC－4.750×10－4BC－2.288×10－3A2－2.813×10－3B2－1.162×10－3C2

根据回归方程做出的各因素的喜树碱得率响应面和等高线图。考察响应面、等高线的形状，分析提取温度、提取时间和料液比对喜树碱提取率的影响，结果见图1～3，各因素及其相互作用对提取率的影响可以通过响应面图和等高线图直观反映出来，最佳工艺为：提取温度49℃，提取时间2.5h，料液比1∶17。

从图中可看出3种因素对喜树碱提取率的影响，提取时间对提取率影响最显著、温度次之，表现为曲面较陡，料液比对喜树碱提取率的影响较小，表现为曲面较缓。

表2 响应曲面实验结果Tab.2 Results of response surface analysis

表3 统计分析结果Tab.3 Results of mathematic regression analysis

图1 喜树碱提取温度、提取时间响应曲面及等高线图A.响应曲面图；B.等高线图Fig.1 Response surface graph and contour line graph of extraction temperature and extraction time of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

图2 喜树碱提取温度、料液比响应曲面及等高线图A.响应曲面图；B.等高线图Fig.2 Response surface graph and contour line graph of extraction temperature and solid－liquid ratio of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

图3 喜树碱提取时间、料液比响应曲面及等高线图A.响应曲面图；B.等高线图Fig.3 Response surface graph and contour line graph of extraction time and solid－liquid ratio of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

较长的提取时间和较高的提取温度有利于喜树碱的提取，但考虑到成本与成分的稳定性，不能无限延长提取时间和增加温度。另外，可能由于喜树碱的含量较低，喜树碱含量不易达到饱和，提取料液比对喜树碱提取率影响不显著。

2.4 验证实验 通过Design Expert软件计算并分析得到最优条件：提取温度49℃，提取时间2.5h，料液比1∶17，在此条件下提取喜树果实喜树碱，实验重复3次，平均提取率为0.048 5%，与预测值0.05%接近。

3 讨论

为考察各提取因素对喜树碱提取率的影响，达到喜树碱提取率最大化，本文选择了喜树碱含量最高的部位果实进行了喜树碱提取工艺优选，以响应曲面法来进行参数的设计与拟合。响应曲面法的原理是将选定影响因子与检验目的指标拟合，得到多元二次回归函数，能够通过响应曲面图和等高线图研究影响因子与响应值、因子与因子之间的相互关系，从而以较少的操作次数在短时间内对所研究的工艺进行优选。本实验得到以喜树碱为响应面值的响应面图和等高图，通过对实验结果的分析，确定了最佳工艺，为实际生产及喜树资源的充分利用提供参考。

［1］Wall M E，Wani M C，Cook C E，et al.Plant antitumor agents I.The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor fromCamptotheca acuminata［J］.J Am Chem Soc，1966，88：3888－3890.

［2］Takimoto C H，Wright J，Arbuck S G..Clinical applications of the camptothecins［J］.Biochim Biophys Acta，1998，1400：107－119.

［3］王甫成.超声技术在中药化学成分提取中的研究进展［J］.广州化工，2010，38（8）：11－12.

［4］沈小钟，杨帆，于荣敏.响应曲面法优选黄芪提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（18）：34－37.

［5］白璐，贺文娟，崔春利，等.Box－Behnken响应面法优化延胡索配方颗粒的提取工艺［J］.西北药学杂志，2013，28（1）：1－4.

［6］谢莹莹，王志祥，史益强，等.响应曲面法优化超临界CO2萃取丁香酚的工艺研究［J］.西北药学杂志，2013，28（2）：122－125.

［7］徐秀泉，于荣敏，刘柯，等.响应曲面法优化茅苍术多糖的提取工艺［J］.安徽农业科学，2011，39（20）：12082－12085.