P糖蛋白在细胞膜的定位和功能研究进展

马园园，颜天华，程 涛，刘雯清，曹永兵，3＊（.中国药科大学，南京 98；.福建中医药大学，福州 350；3.第二军医大学，上海 00433）

我国卫生部2008年公布的全国第三次死因调查报告显示，恶性肿瘤已成为引起我国城乡居民死亡的第二大因素，占死亡总数的22.32%，死于不同程度耐药的肿瘤患者达90%以上。其中有67%的肝癌患者在用抗癌药后很快产生肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR），MDR又是困扰恶性肿瘤临床疗效的主要因素［1－2］。引起 MDR的原因很多，包括P糖蛋白为主的药物外排泵的高表达、肿瘤细胞凋亡通路功能下调、具有耐药特性的肿瘤干细胞、肿瘤微环境改变等［3］，目前P糖蛋白的过表达被认为是引起肿瘤多药耐药的主要原因［4－5］。P糖蛋白是ABC转运蛋白（ATP依赖性转运蛋白）超家族中的代表性成员之一［6］。人类的P糖蛋白由1 280个氨基酸组成包含2个高度一致的NH2氮端以及COOH碳端，由两组610个氨基酸串联重复结构组成，二者之间通过一个约60个氨基酸的linker相连接［7－8］。同时，该蛋白主要转运疏水亲脂性药物，细胞膜脂质能够提供疏水的环境，其双分子层的结构决定了膜上蛋白的功能。研究表明，P糖蛋白是引起MDR的重要原因之一，P糖蛋白作为细胞膜上具有重要功能的转运蛋白，它主要转运疏水亲脂性药物，细胞膜脂质能够提供疏水的环境，这种双分子层的物理化学的结构决定了膜上蛋白的功能。同时P糖蛋白部分定位于脂筏区域内，并且在该区发挥作用，其功能的调节与脂筏中鞘脂和胆固醇的改变有关［9］。因此，鞘脂和胆固醇的改变也可影响P糖蛋白的定位和转运活性［10－11］，本文将对P糖蛋白与膜胆固醇、磷脂和糖脂的关系进行系统阐述。

1 P糖蛋白功能与细胞膜微区脂筏结构组成的关系

细胞膜上的脂质主要包括胆固醇、磷脂和糖脂，磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架，蛋白质分子以覆盖、贯穿、镶嵌3种方式排布于膜上，糖类只存在于膜外，与蛋白质分子结合在一起成为糖蛋白，与脂质结合在一起成为糖脂。P糖蛋白属于跨膜蛋白，在所有的膜蛋白中，P糖蛋白是对所处的脂质环境最敏感的膜蛋白之一［9］。同时P糖蛋白与脂筏有着密切的关系，脂筏又是细胞膜上含有特殊脂质和蛋白质的微区，富含胆固醇和鞘磷脂。研究脂筏的结构是阐明脂筏作用分子机制的基础，已知有许多参与细胞信号转导的分子（包括脂类、酰基化蛋白及膜结合蛋白等）聚集在脂筏的内层，它们在脂筏的定位分布是脂筏作为信号跨膜转导平台的重要结构基础之一［12－13］。最初根据三株多药耐药细胞（HT－29，MCF－7－ADR，BC－19）得出约24%～40%的P糖蛋白定位于脂筏区［2］，后来又有研究表明，细胞株和去污剂的种类都会影响P糖蛋白在脂筏区的定位，他们之间的关系如表1［14］所示。

表1 不同细胞、不同裂解方法提取的脂筏区P糖蛋白所占的比例Tab.1 Recapitulation of the various reported experimental findings of P－gp presence in membrane depending on cell type，caveolin expression，cell lysis technique

从表1可以看出，在部分细胞中用Trition X－100提取的脂筏中的P糖蛋白的含量小于Lubrol、Brij96和碳酸盐缓冲液［14］。另外有文献报道，40%的糖蛋白存在于脂筏区，也是这部分P糖蛋白来发挥其外排的功能［15－16］。因此，脂筏的形成使质膜内层参与信号转导的脂类分子在局部浓集，形成有利于P糖蛋白定位的微环境，这可能是脂筏参与信号转导的分子机制之一。

2 P糖蛋白功能与细胞膜胆固醇之间的关系

胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分，它在细胞膜上主要的功能包括储存能量、加速扩散作用、加速离子的通透、维持膜的流动性和参与蛋白质的磷酸化。甲基β环糊精能够耗竭胆固醇，并且能够增加细胞膜的流动性，从而破坏细胞膜。有研究表明，细胞膜上分子的流动性对P糖蛋白的活性有一定的抑制作用［14］，甲基β环糊精与细胞共孵育后发现P糖蛋白的功能下降，即该蛋白的活性与胆固醇之间有一定的关系，加入环糊精后P糖蛋白功能的变化可能是由细胞膜流动性增加引起的［17］。同时加入环糊精后发现部分P糖蛋白由脂筏区转移到非脂筏区［15］，因此P糖蛋白功能的变化也可能是由P糖蛋白由脂筏区转移到非筏区引起的。

研究表明，细胞膜上胆固醇的组成也会影响P糖蛋白的表达，其中使用低密度脂蛋白和高密度脂蛋白来补充和消耗胆固醇时，分别上调和下调了人巨噬细胞P糖蛋白的表达［18］。另外在MDR1转染的细胞中，胆固醇能够激活P糖蛋白ATP酶的活性，为了进一步研究胆固醇对P糖蛋白ATP酶活性的影响，采用了蛋白增溶试剂CHAPS（3－［（3－胆固醇氨丙基）二甲基氨基］－1－丙磺酸），它是一种蛋白质裂解液，能够保护蛋白质的天然状态，溶解膜蛋白，从而解除蛋白与蛋白质间的相互作用。加入CHAPS获得的P糖蛋白可以用来计算基础ATP酶活性，结果显示，对于胆固醇较少的Sf9昆虫细胞膜，加入CHAPS后P糖蛋白ATP酶活性不增加，细胞裂解后加入皂苷隔绝胆固醇后，P糖蛋白ATP酶活性有所下降，这也进一步说明胆固醇在维持P糖蛋白ATP酶活性中有重要的作用［19－20］。

另外，向Caco－2细胞中加入甲基β环糊精抑制了罗丹明的外排，这种现象伴随着P糖蛋白转移出富含胆固醇的区域［21］。其中罗丹明是一种膜电位敏感的亲脂性阳离子荧光染料，可以自由进入细胞，有较高的荧光量子产率，荧光较强，目前已成为常用的荧光探针物质也是P糖蛋白的特异性底物，可通过检测它在细胞内的积聚情况和外排速度间接反映P糖蛋白的功能。同时在P糖蛋白高表达的表皮细胞中，胆固醇耗竭以后底物维拉帕米的吸收增加即P糖蛋白的功能有所下降［22］。最后，通过比较不同种类的多药耐药细胞对加入甲基β环糊精产生的效应，得出P糖蛋白的功能依赖于细胞总胆固醇的含量［23－24］。

3 P糖蛋白功能与细胞膜磷脂的关系

细胞膜上的磷脂包括磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰丝氨酸（PS）等，其中PC和SM分布于质膜双层的外层，而PE和PS分布于质膜的内层。脂筏部分主要磷脂组分为磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰丝氨酸（PS），非脂筏质膜部分为PC和PE，这说明SM和PS主要分布在细胞质膜的脂筏微域。研究表明，脂筏部分质膜内层的PE和PS含较多的短链脂肪酸或不对称脂酰链，这可能是磷脂分子在脂筏内侧定位分布的重要因素。在细胞膜的脂筏微区，脂筏内层磷脂（PE＋PS）的脂酰链与外层鞘脂的脂酰链相互交错对插，脂筏内外层之间通过疏水的脂酰链相互结合，形成稳定的部分交错对插的脂双层，同时细胞膜多种磷脂组分也是参与细胞信号转导的重要分子［25－26］。

P糖蛋白作为一个完整的膜蛋白，它的部分功能取决于所在的脂质环境，文献研究表明，一些磷脂可能是作为P糖蛋白的底物，从而调节蛋白在膜上的转运活性［27］。另外也有报道说明鞘磷脂和葡萄糖神经酰胺能够参与P糖蛋白的转运作用，因此P糖蛋白除了能够转运有毒外来物，还可以作为外转酶参与细胞膜双侧脂质环境的形成［28－29］。关于脂质外转酶的活性和P糖蛋白关系的研究最初是依据MDR1转染的表皮细胞（未转染的细胞作为对照），检测胞内荧光值。结果表明：在排除了胞吐，向培养液中加入脂质受体后，被标记的短链鞘磷脂从细胞质到细胞外的交换增加［30－31］。通过检测多药耐药CEM／VBL300细胞磷脂的荧光积累，发现这种发生转换的脂质包含许多极性的分子如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等，荧光值在细胞外荧光淬灭后依然存在，并且在加入P糖蛋白抑制剂后荧光值有所下降，说明磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺是P糖蛋白的底物［32］。相同的标记的磷脂酰胆碱荧光实验在KBV1and MCF／ADR细胞上也证实了这个问题，同时结果还显示了磷脂酰胆碱的转运效率低于罗丹明123，与多柔比星的效率相当（罗丹明123和多柔比星都是P糖蛋白的底物）［33］。

4 P糖蛋白功能与细胞膜糖脂的关系

糖脂是含糖而不含磷酸的脂类，普遍存在于原核和真核细胞的质膜上，其含量约占膜脂总量的5%以下，在神经细胞膜上糖脂含量较高，约占5%～10%，糖脂也是两性分子，其结构与SM很相似，只是由一个或多个糖残基代替了磷脂酰胆碱而与鞘氨醇的羟基结合。最简单的糖脂是半乳糖脑苷脂，它只有一个半乳糖残基作为极性头部，在髓鞘的多层膜中含量丰富。变化最多、最复杂的糖脂是神经节苷脂，其头部包含一个或几个唾液酸和糖的残基，神经节苷脂也是神经元质膜中具有特征性的成分。

考虑到糖脂是细胞膜的组成成分之一，也是脂筏重要的组成部分，就有一些报告研究其与P糖蛋白直接或间接的关系，通过检测罗丹明123的外排和多柔比星对卵巢癌2780AD细胞的毒性来说明外源性加入一些神经酰胺衍生物对该蛋白的直接影响，这项实验显示，只有中性的糖脂对P糖蛋白的外排功能起到促进作用，表明糖脂的极性对P糖蛋白发挥作用有重要的影响。同时与敏感细胞相比，P糖蛋白高表达的卵巢癌细胞，葡萄糖神经酰胺的含量增加［34］，研究表明，糖基化产物葡萄糖神经酰胺的增加也存在于 MCF－7－AdrR，OVCAR－3和KB－V1耐药细胞中，并且这种效应可以通过许多多药耐药逆转剂恢复［35］。下面以葡萄糖神经酰胺为例来介绍两者之间的影响：首先，不同浓度的葡萄糖神经酰胺合成抑制剂影响也不同，30μmol·L－1的PDMP（葡萄糖神经酰胺生物合成抑制剂）可以30%抑制HepG2细胞罗丹明的外排，而当浓度小于15μmol·L－1没有发现抑制作用［36］。其次，采用基因转染或者反义引物的方法来控制葡萄糖神经酰胺的表达时发现，当表达被激活时可以诱导 MCF－7和 MCF－7／ADR耐药性都增强，而在抑制其表达时，耐药细胞敏感性增强得比较明显［37］。为了进一步研究，研究者又考察了PDMP对P糖蛋白的磷酸化的影响，结果表明PDMP能够明显抑制P糖蛋白的磷酸化，同时外源性地加入鞘糖脂GD3后P糖蛋白的磷酸化得到了恢复［38］，因此糖脂可能是通过调节P糖蛋白的磷酸化来改变其外排功能。

5 小结

膜脂质主要由磷脂、胆固醇和少量糖脂构成，在大多数细胞的膜脂质中，磷脂占总量的70%以上，胆固醇不超过30%，糖脂不超过10%。磷脂中含量最多的是磷脂酰胆碱，其次是磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺，含量最少的是磷脂酰肌醇。磷脂、胆固醇和糖脂都是双嗜性分子，磷脂分子中的磷酸和碱基、胆固醇分子中的羟基以及糖脂分子中的糖链等亲水性基团分别形成各自分子中的亲水端，分子的另一端则是疏水的脂肪酸烃链，这些分子以脂质双层的形式存在于质膜中，亲水端朝向细胞外液或胞质，疏水的脂肪酸烃链则彼此相对，形成膜内部的疏水区。膜脂质双层中的脂质构成是不对称的，含氨基酸的磷脂（磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇）主要分布在膜的近胞质的内层，而大部分的磷脂酰胆碱和全部糖脂都分布在膜的外层。在所有的膜蛋白中，P糖蛋白作为一种重要的膜蛋白，是对所处的脂质环境最敏感的膜蛋白之一［9］。该蛋白与细胞膜上的脂质环境有着密不可分的关系，膜脂质的变化影响该蛋白的定位，从而影响该蛋白的活性。P糖蛋白也会作为一种外转运酶影响脂质的合成［30］，同时P糖蛋白的过表达被认为是引起肿瘤多药耐药的主要原因［8－9］，因此明确细胞膜脂质和P糖蛋白的关系，能为找到耐药逆转剂提供强有力的帮助。

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