大黄鱼溶藻弧菌病组织中巨噬细胞移动抑制因子的检测及意义
2014-10-27桑本红徐晓津毛勇王军苏永全
桑本红,徐晓津*,毛勇,王军,苏永全
(1.集美大学 水产学院 福建省海洋渔业资源与生态环境重点实验室,福建 厦门361021;2.厦门大学 海洋与地球学院,福建 厦门361005)
1 引言
大黄鱼Lari michthyscrocea是我国主要海洋经济鱼类之一,是我国养殖规模最大的海水鱼类和我国八大优势出口养殖水产品之一[1]。但随着养殖规模的扩大,各种传染性疾病发生日益频繁,严重制约大黄鱼养殖业的健康发展,其中由溶藻弧菌Vibrioal ginol yticus引起的弧菌病是养殖大黄鱼最常见的传染性疾病之一,其发病率和死亡率高,给大黄鱼养殖业带来严重的经济损失[2]。
巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种哺乳动物宿主炎症反应不可缺少的组成成分[3],能抑制巨噬细胞移动。Ber nhagen等发现,当垂体前叶细胞暴露于内毒素脂多糖(LPS)后,就会释放 MIF分子,表明MIF是联系内分泌和免疫系统的中介因子[4]。近年来,许多研究证明MIF在细胞增殖的调控、细胞凋亡以及生长因子的表达、恶性肿瘤的演进等方面起着重要的作用[5]。MIF还参与哺乳动物很多急性、慢性炎症反应的发病机制,包括败血症、关节炎、肾小球肾炎、炎性肠炎和特异性皮炎等[6]。但是MIF的过度表达,会引起免疫系统功能紊乱,出现全身性炎症反应综合症。
国内外学者对人与动物的 MIF研究较多[7-8],而鱼类MIF的研究主要是关于大黄鱼、斑马鱼、红鳍东方鲀、黄鳍金枪鱼等MIF基因的研究[9-12],对MIF与鱼炎症关系的报道较少[7]。而已有研究表明,MIF在人及动物炎症疾病组织中的表达水平远远超过正常组织[13],MIF存在于多种器官的正常组织中,并参与多种疾病的病理形成过程,如动脉粥样硬化、急性呼吸窘迫综合症及溃疡性结肠炎等炎症性疾病[14]。说明MIF与炎症疾病的发病机制有着密切的关系。本文采用免疫组化染色方法检测MIF在大黄鱼溶藻弧菌病组织和健康鱼正常组织中的表达,探讨其表达水平与病理特征的关系,为其应用于大黄鱼弧菌病的预后判断提供依据。对进一步寻找有效的预防、诊断和治疗方法均具有重要意义。
2 材料与方法
2.1 材料
在福建省宁德市海鸥公司的海水网箱养殖场,取体质量约350~450 g的健康大黄鱼200尾,分2组暂养于养殖池,每组100尾。每天换水1次,投饵2次,水温24~25℃,暂养1周无异常后开始实验。试验菌株溶藻弧菌分离自患病大黄鱼,经回归感染证明具有较强毒力[2],于本实验室-80℃保存。取-80℃保存菌株接种于含2%NaCl的营养琼脂斜面,28℃过夜培养,用灭菌生理盐水洗脱菌苔,稀释至2×107CFU/mL后用于感染实验。大黄鱼感染前用丁香酚麻醉,感染组每尾腹腔注射菌悬液0.2 mL,对照组每尾注射灭菌生理盐水0.2 mL。感染7 d后分别从感染组取有典型病症的大黄鱼和从对照组随机取大黄鱼各6尾,取脾、肝、头肾、肠组织,用10%甲醛溶液固定24 h。石蜡包埋,切片厚度为4μm。
2.2 方法
采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P)法。大黄鱼MIF多克隆抗体(由厦门大学海洋与地球学院实验室提供)[13],MIF一抗的稀释浓度为1∶200。染色试剂盒SP-9001、浓缩性DAB试剂盒、兔超免二步法试剂为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。免疫组织化学染色方法见参考文献[17],操作步骤参照试剂盒说明书进行。常规脱蜡、水化,滴加5 ml 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性,室温下10 min;PBS冲洗,5 min×3次;0.5%BSA封闭1 h,滴加一抗(MIF),4℃,过夜,PBS冲洗,5 min×3次;滴加二抗,37℃孵育20 min;DAB显色,10 min,室温;PBS冲洗,5 min×3次;苏木素复染,5 min,水冲洗;盐酸酒精分化,水冲洗,酒精梯度脱水、二甲苯透明后,中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。用已知阳性的溶藻弧菌病大黄鱼组织作为MIF的阳性对照。
2.3 结果判断
MIF阳性细胞主要定位于细胞质,呈棕黄色染色为阳性细胞。每张切片高倍镜下随机选取10个视野共纪录1 000个细胞,以染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分作半定量分析[4]。(1)按切片中细胞着色深浅评分:0分为细胞无显色;1分为淡黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色。(2)按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分:0%~5%为0分,6%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分。每张切片随机取5个400倍视野,每个视野均进行阳性细胞百分比计分与染色强度计分,再按这(1)、(2)两项指标的积分相加将结果分为4级:0分为阴性(-),1~2分为弱阳性(+),3~4分为中度阳性(++),5~7分强阳性(+++)。
2.4 统计学处理
应用SPSS 16.0统计软件包,采用四格表χ2检验进行分析,p<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 MIF在溶藻弧菌病大黄鱼组织中的表达
3.1.1 MIF在溶藻弧菌病大黄鱼肠组织中的表达
MIF在健康大黄鱼大肠组织中表达阴性(见图1a)。感染溶藻弧菌患病大黄鱼肠绒毛呈不整齐、模糊不清、崩解,肠壁黏膜下层及肌肉层结构松散,出现许多空泡。MIF在患病大黄鱼肠组织呈阳性表达,MIF在肠固有层、黏膜层与黏膜下层着色较强,棕黄色细颗粒较多(见图1b、1c)。
3.1.2 MIF在溶藻弧菌病大黄鱼脾组织中的表达
健康大黄鱼脾组织MIF无表达(见图1d)。感染溶藻弧菌患病大黄鱼脾窦和脾索不清晰,分界不明显,MIF在患病大黄鱼脾组织中阳性表达,呈灶状或弥漫性分布,以细胞质为主,部分为胞膜着色,为棕黄色颗粒,阳性细胞在脾组织中的分布不均匀(见图1e)。
3.1.3 MIF在溶藻弧菌病大黄鱼头肾组织中的表达
大黄鱼头肾无被膜,外周仅有一层胶原纤维包裹。头肾实质中无肾单位,属于网状淋巴组织。MIF在健康大黄鱼大肠组织中不表达(见图1f)。感染溶藻弧菌后,头肾出现较多空泡。组织中可见大量的阳性细胞,而且染色强度为黄色至棕褐色,呈强阳性高表达(见图1g、1h)。
3.2 大黄鱼溶藻弧菌病各免疫器官MIF免疫组织化学比较研究
MIF在健康大黄鱼头肾、脾、肠各组织中均无表
达;MIF在感染溶藻弧菌患病大黄鱼肠表达强阳性为49%,阳性率为56%(表1)。MIF在患病大黄鱼脾表达强阳性为41%,阳性率为64%(表2)。MIF在患病大黄鱼头肾表达强阳性为89%,阳性率为92%(表3)。说明MIF在病鱼头肾中强阳性表达率最高,MIF在溶藻弧菌病大黄鱼表达强度从弱到强依次是肠、脾、头肾(表1、2、3)。
图1 MIF在大黄鱼各组织中的表达Fig.1 MIF immunohistochemistry in the healthy tissues and diseased tissues of Lari michthys crocea challenged with Vibrio al ginol yticus
表1 MIF在健康大黄鱼与溶藻弧菌病大黄鱼肠中的表达Tab.1 Synopsis of MIF reactivity in the intestines of Larimichthys crocea bet ween healthy and diseased fish
表2 MIF在健康大黄鱼与溶藻弧菌病大黄鱼脾中的表达Tab.2 Synopsis of MIF reactivity in the spleen of Larimichthys crocea bet ween healthy and diseased fish
表3 MIF在健康大黄鱼与溶藻弧菌病大黄鱼头肾中的表达Tab.3 Synopsis of MIF reactivity in the head kidney of Larimichthys crocea between healthy and diseased fish
4 讨论
巨噬细胞移动抑制因子(MIF)来源于垂体前叶[15]、外周的单核与巨噬细胞[16],是一种含有115个氨基酸的蛋白质,并且受下丘脑垂体控制的多功能性细胞因子。MIF作用较为广泛,是炎症介质,MIF将巨噬细胞限制在异位灶处,并增强了巨噬细胞的分泌功能,能限制巨噬细胞在炎症区域的移动,也能激活巨噬细胞,使其通过自身分泌和旁分泌作用分泌多种细胞因子,包括TNF-α、IL-1等,促进炎症的发生发展,同时激活和趋化更多的巨噬细胞聚集[17],增强其黏附、吞噬和抗肿瘤作用,又具有抑制巨噬细胞移动的特性,是重要的促炎症反应介质,在多种炎症与自身免疫反应性疾病起着很重要的作用。MIF参与多种生理生化过程,如:炎症反应、免疫应答、细胞增殖、血管生成以及肿瘤形成等过程。在炎症反应和免疫调节中起重要作用[18]。
近年大黄鱼炎症疾病发病率增高,MIF与鱼类炎症疾病的关系如何,迄今未见文献报道。本实验以免疫组化法检测MIF在溶藻弧菌病大黄鱼头肾、脾、肠等组织中的表达,结果表明MIF在健康对照组大黄鱼组织中无表达;MIF在患病大黄鱼头肾、脾、肠强阳性表达分别为89%、41%、49%,提示MIF与鱼炎症疾病有关。目前有关MIF的研究主要集中在人与动物的恶性肿瘤方面[19-20],对许多细胞分子的研究表明,MIF作为在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用的细胞因子,在胃炎、胃癌的发生发展中起了很重要的作用[21]。而一些体内外实验证明,幽门螺杆菌能诱导MIF表达增强,幽门螺杆菌阳性的胃黏膜上皮细胞、T细胞、单核细胞MIF表达阳性显著高于幽门螺杆菌阴性者,单核细胞与幽门螺杆菌共同培养后单核细胞表达MIF阳性显著增加,幽门螺杆菌感染与胃上皮及炎症细胞MIF蛋白表达有关[21],本研究结果中头肾与脾作为大黄鱼免疫器官,含有单核细胞等免疫细胞,MIF在溶藻弧菌病大黄鱼免疫器官头肾与脾中阳性表达率较高,高于在患病大黄鱼中肠的表达,尤其在病鱼头肾中MIF阳性表达92%。MIF在患病大黄鱼肠表达强度阳性率为56%,MIF在溶藻弧菌病大黄鱼组织中表达强度从弱到强依次是肠、脾、头肾。而健康大黄鱼组织MIF表达阴性,同样说明溶藻弧菌感染与鱼炎症细胞MIF蛋白表达有关。
而BESWICK等体外实验证实幽门螺杆菌能通过Cag A刺激胃黏膜上皮细胞产生MIF,促进胃黏膜上皮细胞增殖,而用抗MIF抗体能阻滞胃上皮细胞增殖,提示MIF在幽门螺杆菌诱导的胃上皮细胞增殖中可能扮演重要的作用[22]。于晓辉等研究40例人胃癌组织中MIF阳性表达例数明显高于正常胃黏膜[23]。与这些人与动物疾病组织中MIF表达研究报道相似,本研究结果表明MIF在健康大黄鱼组织中无表达,在溶藻弧菌病大黄鱼头肾、脾、肠等组织病变中高表达。显示MIF在大黄鱼溶藻弧菌病发病中发挥某种重要作用,但具体的发病调控机制尚需进行进一步的研究和探讨,而深入了解其作用机制可能为鱼类炎症疾病治疗开辟新的途径。
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