全氟辛烷羧酸(PFOA)与全氟辛烷磺酸(PFOS)的细胞毒性效应

端正花，王勋功，王华，李宁涛，朱琳

1. 天津理工大学环境科学与安全工程学院，天津300384 2. 天津出入境检验检疫局工业产品安全技术中心，天津300191 3. 南开大学环境科学与工程学院，天津300071

全氟辛烷羧酸(PFOA)与全氟辛烷磺酸(PFOS)的细胞毒性效应

端正花1，王勋功1，王华2，李宁涛2，朱琳3,*

1. 天津理工大学环境科学与安全工程学院，天津300384 2. 天津出入境检验检疫局工业产品安全技术中心，天津300191 3. 南开大学环境科学与工程学院，天津300071

新型污染物全氟辛烷羧酸(PFOA)与全氟辛烷磺酸(PFOS)在全球范围内的各种环境介质中被广泛检出，对生态安全和人体健康造成威胁。利用MTT(噻唑蓝)法研究了PFOA/PFOS对人体细胞的毒性效应。结果表明，低剂量PFOA和PFOS对人体正常肝细胞增殖具有显著毒性，其3 d半数抑制浓度(IC50值)分别约为5和0.5 μg·L-1。此外，PFOA和PFOS均对MCF-7细胞增殖表现出显著的非单调剂量-毒性效应，并且在环境浓度范围(< 0.6 μg·L-1)内均可促进MCF-7细胞增殖，表现出潜在的类雌激素作用风险。

全氟辛烷羧酸(PFOA); 全氟辛烷磺酸(PFOS)；肝细胞；MCF-7；非单调剂量效应关系

近年来，新型污染物全氟化合物(perfluorinated compounds, PFCs)在生产领域被大规模使用，导致这类物质广泛进入全球环境。由于很难被降解且具有生物蓄积性，PFCs被认为是一类新型的持久性有机污染物[1]，在水体[2]、生物体[3]、人体组织[4]和食物[5]中被广泛检出，甚至在北极地区的生物体及环境介质中均有PFCs检出[6]。PFCs类化合物最终会部分转化为全氟辛烷羧酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)，这2种物质是PFCs中应用最为广泛的，尤其是PFOS，它在生物体内的蓄积水平是二恶英等的数百至数千倍[1]。因此，PFOA和PFOS的毒性研究已成为生态环境污染领域的热点问题[7-9]。

PFOA与PFOS作为持久性新型环境污染物，已发现其在生物的生殖、发育、神经、免疫、遗传等方面具有毒性[10]。但是目前PFCs的毒性研究多数集中于哺乳动物的急性毒性研究，且使用的暴露剂量明显高于环境中的实际含量[11]。PFCs对人类的毒性效应仅限于小范围人群的流行病学研究[12]。许多种类的外源性物质都有可能对不同的人体细胞产生毒性作用，同时研究发现肝脏比其他内脏更容易富集长链的PFCs[13]，因此本实验首先探讨了PFOA与PFOS对人体正常肝细胞株的细胞增殖毒性。另外，据动物体内实验证明，PFCs具有类雌激素作用[14-15]。因此，本实验进一步通过研究PFOA与PFOS对雌激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7的毒性作用，初步分析其类雌激素作用。从而为PFCs的多介质环境行为、健康风险和控制原理的研究提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

人张氏肝细胞株(Chang liver)，购自武汉博士德生物工程有限公司；人乳腺癌细胞株(MCF-7)，南开大学生命科学学院惠赠。PFOS和PFOA(纯度≥99.9%)购自Sigma-Aldrich公司，其他试剂购自武汉博士德生物工程有限公司。

配制PFOS和PFOA母液5 mg·L-1：称取一定量的PFOS和PFOA粉末，加入少量二甲基亚砜(DMSO)助溶(实际暴露溶液中DMSO的体积分数不超过0.1%，经溶剂对照实验，此浓度对实验结果无影响)，再溶于含有10%(质量分数)胎牛血清的1640完全培养基中。

1.2 细胞的传代和培养

将人体肝细胞和MCF-7细胞分别置于含有10%(质量分数)胎牛血清的1640完全培养基中，在条件为37 ℃、5% CO2的细胞培养箱(美国Thermo, 3110)内培养，每隔2 d更换1次培养基。

吸去培养皿中的完全培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗培养皿，洗去细胞表面上的完全培养基；吸去PBS，加入1 mL胰蛋白酶放入培养箱中消化细胞2 min；取出培养皿加入1 mL完全培养基终止消化；吹散贴在壁上的细胞后，将细胞悬液置于离心管中，以1 000 r·min-1离心(德国Hettich, Rotina 420)3 min；弃去上清液，加入完全培养基用移液枪反复吹散至单细胞状态，以1/2比例传代培养。

1.3 MTT法检测

取对数生长期的人体肝细胞和MCF-7细胞制成单细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔板(美国Thermo)，调整细胞悬液的浓度，使每孔加入100 μL细胞悬液后每孔约有1×104个细胞。在37 ℃、5% CO2条件下置于细胞培养箱中培养24 h待细胞贴壁。24 h后吸去每孔中的完全培养基，空白对照组加入含有10%(质量分数)胎牛血清的1640完全培养基100 μL，实验组分别在每孔中加入含有不同浓度(0、0.5、5、500和5 000 μg·L-1)的PFOS或PFOA的完全培养基100 μL，每组设置个10复孔。将细胞分别培养24 h、48 h和72 h。培养结束后，吸去完全培养基，每孔加入20 μL浓度为5 mg·mL-1的MTT溶液(噻唑蓝溶液)，继续在培养箱中培养4 h。而后吸去MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO溶液，震荡10 min，用酶标仪(美国Thermo, FC)在492 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值。

1.4 数据统计

实验所得数据为96孔板各孔的吸光度(A)值，用Excel中的常用函数AVERAGE计算每组10个复孔吸光度(A)值的平均值，用常用函数STDEV计算每组的标准偏差，用统计函数TTEST比较每个浓度组与空白对照组的差异，如p<0.05，则认为有显著的差异。

2 结果(Results)

2.1 PFOA和PFOS对人体肝细胞的细胞增殖毒性

如图1所示，3 d内空白对照组人体正常肝细胞都呈对数增长趋势，说明本实验细胞体系稳定可靠。

经PFOA和PFOS暴露1 d后，从5 μg·L-1浓度组开始，细胞增殖受到显著的抑制作用(p(PFOA)=0.006；p(PFOS)=0.005)。暴露2 d后，最低浓度组(0.5 μg·L-1)也都表现为抑制肝细胞增殖(p(PFOA)=0.005；p(PFOS)=0.0005)。PFOA的3 d半数抑制浓度(3 d-IC50)约为5 μg·L-1，而PFOS的3 d-IC50约为0.5 μg·L-1，从这个指标来看，PFOS对肝细胞增殖抑制的毒性更大。

2.2 全氟辛烷羧酸(PFOA)与全氟辛烷磺酸(PFOS)对MCF-7的细胞增殖毒性

如图2所示，5 d内空白对照组MCF-7都呈对数增长趋势，说明本实验细胞体系稳定可靠。

由图2可见，经PFOA暴露1～3 d后，各浓度组均促进MCF-7细胞增殖(p<0.05)；暴露4 d后低浓度组(0.5 μg·L-1和5 μg·L-1)继续促进细胞增殖，表现为类雌激素效应，500 μg·L-1组无显著细胞毒性(p=0.112)，最高浓度组(5 000 μg·L-1)表现出抑制细胞增殖作用(p=0.023)；暴露5 d后低浓度组(0.5 μg·L-1和5 μg·L-1)继续促进细胞增殖(p<0.05)，500 μg·L-1组无细胞毒性(p=0.272)，最高浓度组(5 000 μg·L-1)抑制细胞增殖(p=0.039)。由此可见，PFOA对MCF-7的细胞增殖表现出非单调剂量-效应毒性。 PFOS暴露1 d后，各浓度组均无毒性效应，而PFOA暴露1 d后甚至最低浓度组(0.5 μg·L-1)都表现出刺激MCF-7细胞增殖作用(p=0.01)，因此从这个指标看PFOA的类雌激素作用更强；暴露2 d后PFOS各浓度组均促进细胞增殖(p<0.05)；暴露3 d后则表现出非单调剂量-效应毒性，即低浓度(0.5、5和500 μg·L-1组)继续促进细胞增殖(p<0.05)，最高浓度组(5 000 μg·L-1)表现为抑制细胞增殖。可见，PFOA和PFOS对MCF-7细胞增殖的毒性作用总体规律相同。

图1 PFOA/PFOS对人体肝细胞增殖的毒性作用注：* p<0.05，** p<0.01，与空白对照组相比，下同。Fig. 1 Toxicity of PFOA/PFOS to the proliferation of human liver cellsNote: *p<0.05, ** p<0.01, compared with the control group, the same below.

图2 PFOA/PFOS对MCF-7细胞增殖的毒性作用Fig. 2 Toxicity of PFOA/PFOS to the proliferation of MCF-7 cells

3 讨论(Discussion)

城市工业污水中PFCs的含量较高，比如泰国工业区污水处理厂出水中检测出的PFCs总浓度高于0.6 μg·L-1[16]。人体血清中PFOA和PFOS的平均浓度约为10 μg·L-1[17]。Liu等[18]以原代培养的罗非鱼肝脏细胞为实验对象，证明高浓度(>1 000 μg·L-1)的PFOA和PFOS具有细胞毒性效应，并且认为目前的污染程度对鱼类生殖发育带来的风险很小。本实验所选取的最低浓度0.5 μg·L-1低于环境暴露浓度。PFOA和PFOS在该浓度下抑制人正常肝细胞的增殖，并且随着浓度的增大，抑制作用增强，证明了环境中PFOA和PFOS对于人体正常细胞存在毒性。究其原因，PFOA和PFOS都能诱导氧化自由基(ROS)的产生[19-20]，从而导致肝细胞凋亡。但是本实验中PFOS对正常肝细胞增殖抑制的IC50值显著低于PFOA，即PFOS对正常肝细胞增殖抑制的相对毒性较大。这与前人的研究结论是一致的[21-22]。研究发现PFOS和PFOA都能抑制细胞间歇连接通讯这一细胞膜功能[23]，但是PFOS还能提高细胞膜对疏水性配体的渗透性能，从而使PFOS在生物个体中具有较高的生物富集速度，而PFOA的渗透及富集速度则比较缓慢[13]。因此可推测PFOS在同浓度下比PFOA进入生物体速度快，富集速度也快，对生物影响更大。

本实验以应用最为广泛的具有环境雌激素受体阳性特征的MCF-7细胞为研究对象，探讨了环境浓度的PFOA和PFOS的内分泌干扰风险。Henry等[24]研究发现PFOA在高浓度(3 000 μg·L-1)对MCF-7细胞具有细胞毒性，而在30 μg·L-1则无任何毒性表征。本实验在高浓度组(5 000 μg·L-1)也发现PFOA和PFOS对MCF-7细胞具有细胞毒性。但是在低浓度范围(0.5～5 μg·L-1)下，PFOA和PFOS对MCF-7细胞增殖还有具有显著的促进作用，提示其在环境浓度下具有类雌激素作用。PFOA和PFOS对MCF-7的细胞毒性存在非单调剂量-毒性效应。暴露1 d后，PFOS各浓度组均无毒性效应，而PFOA甚至在最低浓度组(0.5 μg·L-1)表现出刺激MCF-7细胞增殖，从这个指标看PFOA的类雌激素作用更为明显。据报道PFOA能抑制G-蛋白偶联的受体蛋白信号通路[25]。G-蛋白偶联的雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor1, GPER)是迄今发现的最重要的雌激素膜性受体[26]。但是，是否由于这些特性的异同造成PFOA和PFOS类雌激素效应的差距，还有待于进一步分析。

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TheCytotoxicEffectofPFOAandPFOS

Duan Zhenghua1, Wang Xungong1, Wang Hua2, Li Ningtao2, Zhu Lin3,*

1. School of Environmental Science and Safety Engineering, Tianjin University of Technology, Tianjin 300384, China 2. Technical Center for Safety of Industrial Products, Tianjin Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau, Tianjin 300191, China 3. College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China

6 December 2013accepted3 January 2014

The new pollutants perfluorooctanoic acid (PFOA) and perfluorooctane sulfonate (PFOS) is widely detected in various media within global scope, and thus posing a hazard to environment and human health. The cytotoxic effect of PFOA and PFOS was studied with the method of MTT in this paper. The results showed that low-dose PFOA/PFOS exposure had significant toxicities to the proliferation of normal human liver cells, and the values of their 3 d half maximal inhibitory concentration (IC50) were 5 and 0.5 μg·L-1. Meanwhile, both of PFOA and PFOS had significant non monotonic dose-effect relationship in the toxicity to the proliferation of MCF-7 cells, and they could promote the proliferation of MCF-7 cells within the scope of environmental concentrations (< 0.6 μg·L-1), which showed their potential estrogen actions.

PFOA；PFOS; liver cell; MCF-7; non monotonic dose-effect

国家质检总局科技计划项目(2012IK213)

端正花(1981-)，女，博士，讲师，主要研究方向为环境生物技术，E-mail: duanzhenghua@mail.nankai.edu.cn；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: zhulin@nankai.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20131206001

端正花, 王勋功, 王华，等. 全氟辛烷羧酸PFOA与全氟辛烷磺酸PFOS的细胞毒性效应研究[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(2): 353-357

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2013-12-06录用日期2014-01-03

1673-5897(2014)2-353-05

X171.5

A

朱琳(1957—)，男，环境科学博士，教授，主要研究方向为生态毒理学和环境生物学，发表学术论文30余篇。