离子液体[C8mim]Cl对泥鳅胚胎和仔鱼的毒性

南平，王琼琼，亓蒙，翟胜娜，张玉玲，易叔红，常重杰

河南师范大学 生命科学学院，新乡 453007

离子液体[C8mim]Cl对泥鳅胚胎和仔鱼的毒性

南平，王琼琼，亓蒙，翟胜娜，张玉玲，易叔红，常重杰*

河南师范大学 生命科学学院，新乡 453007

以泥鳅的胚胎及仔鱼为试验材料，选择胚胎发育的4个不同时期(囊胚期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期)及仔鱼期为处理开始的时间点，探讨了离子液体[C8mim]Cl的毒性作用。结果表明，随着[C8mim]Cl浓度增加，泥鳅胚胎的孵化率下降，畸形率上升，具有明显的剂量-效应关系，67～150 mg·L-1的[C8mim]Cl对泥鳅胚胎均表现出明显的致畸毒性效应；随着[C8mim]Cl浓度增加，泥鳅仔鱼死亡率上升，而100～225 mg·L-1的[C8mim]Cl对泥鳅仔鱼具有明显的致畸、致死作用。其中，[C8mim]Cl对孵出期泥鳅仔鱼的24 h、48 h的半致死浓度分别为97.95和86.77 mg·L-1；而[C8mim]Cl对孵出后3 d泥鳅仔鱼的24 h、48 h的半致死浓度分别为73.77和40.98 mg·L-1。由上可知,在一定的剂量内，[C8mim]Cl对泥鳅胚胎及仔鱼的发育有明显的致畸、致死作用，这为离子液体[C8mim]Cl的合理使用提供了理论依据。

泥鳅；[C8mim]Cl；胚胎发育；毒性

离子液体是一类完全由离子组成的室温下呈液态的新型化学试剂，因其不挥发、不易燃和热稳定等优势，具有广阔的应用前景，曾被认为是环境友好的“绿色溶剂”。然而近几年研究发现离子液体对环境和生物体有潜在风险，有些离子液体甚至是强毒性的[1-2]。此外，大部分离子液体水溶性较强，在其合成和应用中，它们很可能通过废液残留、工业污水排放等途径进入水体中，从而对环境特别是水环境产生潜在的威胁[3]。目前，有关离子液体生物毒性的研究还处于初步阶段，国内外的研究报告多集中于不同类型的离子液体对各种生物体的急性毒性效应方面[3-5]。本研究以泥鳅为受试动物，研究了离子液体对水生生物的胚胎发育毒性和仔鱼的生物毒性效应，旨在探讨离子液体对水生生物的毒性影响。

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)属鲤形目、鳅科、泥鳅属，分布较广，且易于在实验室饲养。因此，在毒性试验研究中，是理想的水生生物试验材料[6]。另外，已有研究表明：鱼类的胚胎期和仔鱼期是整个生活史中对各种药物最为敏感的时期[7]。因此，可以利用其胚胎和仔鱼来评价多种化合物及各种环境的毒性影响。目前，已有关于斑马鱼、金鱼、草鱼、鲤鱼、黑鲷等水生生物胚胎毒性试验的报道[8-12]，但有关咪唑类离子液体氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Cl)对泥鳅的胚胎毒性的研究尚未见报道。本研究探讨了[C8mim]Cl对泥鳅胚胎及仔鱼的毒性影响，从而为制定离子液体[C8mim]Cl水卫生标准及渔业用水水质标准提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

成体泥鳅(体重20～30 g，体长 13～17 cm)，购于河南新乡市鸿达市场。[C8mim]Cl，纯度>99%，购自上海成捷化学有限公司；绒毛膜促性腺激素(HCG)，购于新乡市兽医药店。

1.2 实验方法

受精卵的制备：在生殖季节，选取性成熟雌雄泥鳅各10尾，采用背部肌肉注射法注射兽用绒毛膜促性素(HCG)，其中雌鱼为800 IU·尾-1；雄鱼注射剂量减半。10～14 h 后，轻压雌鳅腹部，立即将卵收集于不同的培养皿中，干法受精[2]，获得受精卵，备用。

试验设计：参照预实验的结果，设30、44、67、100、150、225 mg·L-1共6个处理组和1个空白对照组，每组均设3个平行样，置于直径12 cm的培养皿中(100受精卵/培养皿)。在胚胎染毒组，选取30～150 mg·L-1共5个处理浓度的离子液体溶液[C8mim]Cl(100 mL/培养皿)，分别于囊胚期、原肠胚中期、神经胚期和尾芽期开始处理；而在仔鱼孵出期和卵黄吸收期则选择44～225 mg·L-1共5个处理浓度的[C8mim]Cl(100 mL/培养皿)进行染毒处理，每24 h更新其相应的处理液、及时剔除死亡个体，并利用解剖显微镜连续观察其发育状况并及时拍照、记录。其中仔鱼各处理组在处理48 h后终止试验(仔鱼卵黄囊吸收完毕后每天上、下午各投喂1次蛋黄)，其他处理组在仔鱼孵化出后即终止试验。根据文献[2]的计算公式，计算出各处理组的胚胎孵化率、畸形率，及其仔鱼半致死浓度，并推算出其相应的安全浓度。

1.3 数据统计分析

所有数据均采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，同时还利用了Excel 2003进行分析作图，数据结果用平均数±标准差表示。显著性差异以p值表示，p< 0.05(*)表示差异显著；p< 0.01(**)表示差异极显著。

2 结果(Results)

2.1 [C8mim]Cl对泥鳅胚胎孵化率、畸形率的影响

[C8mim]Cl对泥鳅胚胎发育的影响如图1和图2所示。总体而言，其胚胎的主要致畸症状表现为：受精卵发育异常，如胚盘异常凸起(图1A)，胚盘下包异常(图1B)，胚体浑浊或自行解体(图1C)；卵黄吸收异常，如卵黄膨大、崩解等(图1D)。与对照组比较，随着离子液体[C8mim]Cl浓度的增加，胚胎孵化率下降，其中，较高浓度处理组(100～150 mg·L-1)显著下降(p< 0.01)，具有明显的剂量-效应关系；同时，[C8mim]Cl对泥鳅胚胎有明显的剂量-致畸效应关系，胚胎畸形率随[C8mim]Cl的浓度增加而上升，其较高处理组(44～150 mg·L-1)的畸形率上升达极显著水平(p< 0.01)。而比较4个不同处理时期的处理效应，结果发现，从囊胚期开始处理时，胚胎的孵化率受抑制作用最强；而尾芽期开始处理时其胚胎畸形率最显著。

图1 [C8mim]Cl对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)胚胎、仔鱼的毒性效应注：A1，正常囊胚；A2，畸形囊胚；B1，正常原肠胚；B2，畸形原肠胚；C1，正常神经胚；C2， 畸形神经胚；D1，正常尾芽；D2，畸形尾芽；E1，正常仔鱼；E2，畸形仔鱼。Fig. 1 Toxic effect of [C8mim]Cl on the embryos and larvae of loach (Misgurnus anguillicaudatus)Note: A1, normal blastaea; A2, malformed blastaea; B1, normal gastrula; B2, malformed gastrula; C1, normal neurula; C2, malformed neurula; D1, normal tail bud; D2, malformed tail bud; E1 , normal laval fish; E2, malformed laval fish.

图2 [C8mim]Cl对泥鳅胚胎孵化率和畸形率的影响注：A，囊胚期处理；B，原肠胚期处理；C，神经胚期处理；D，尾芽期处理。Fig. 2 Effect of [C8mim]Cl on the hatching rate and abnormal embryo rate of M. anguillicaudaius embryosNote: A, blastoderm stage processing; B, mid-gastrulae stage processing; C, neurula stage processing; D, tail bud stage processing.

2.2 [C8mim]Cl对泥鳅仔鱼死亡率的影响

[C8mim]Cl对泥鳅仔鱼死亡率的影响结果如表1所示。在处理1～2 h时，泥鳅仔鱼活动开始加快。随着处理时间的延长，仔鱼表现出明显的致畸症状，如弯体或弯尾等(图1E)，且其摄食能力明显降低，最终死亡。由表1可知，随着[C8mim]Cl浓度的增加，泥鳅仔鱼的死亡率增加。根据改进的寇氏法(Karber)可推算出[C8mim]Cl对孵出期泥鳅仔鱼的24 h、48 h的LC50浓度及安全浓度分别为：97.95、86.77、20.43 mg·L-1，而其对孵出3 d的泥鳅仔鱼的24 h、48 h的LC50浓度及安全浓度分别为：73.77、40.98、3.794 mg·L-1。由上可知，刚孵化出的泥鳅仔鱼24 h、48 h的LC50浓度及安全浓度均高于孵化后3 d的泥鳅仔鱼。

表1 [C8mim]Cl染毒后泥鳅仔鱼的死亡率Table 1 Mortality rate of M. anguillicaudaius larvae induced by [C8mim]Cl

3 讨论(Discussion)

离子液体因没有蒸汽压，在使用过程中本身不会形成挥发性有机物而被称为“绿色产品”，被认为是工业上挥发性的有机化合物的绿色替代品。但离子液体本身并非“绿色”产品，某些离子液体有毒且难以降解[13-14]。另外，离子液体虽降低了对空气污染的可能性，但是，因其具有极大的水溶性，排放到环境中后，将对水环境造成危害。因此，Ranke等[15]提出应结合多学科知识对其潜在危害性进行综合评价。

本研究探讨了[C8mim]Cl对泥鳅的胚胎及其仔鱼的毒性效应，选择胚胎发育的4个不同时期(囊胚期、原肠胚期、神经胚期、尾芽期)，以及刚孵化出的仔鱼为处理开始的时间点，分别以泥鳅胚胎的孵化率和畸形率，泥鳅仔鱼的死亡率为研究指标。结果表明，[C8mim]Cl对泥鳅胚胎及仔鱼的发育具有明显的抑制、致畸、致死作用，如67～150 mg·L-1的[C8mim]Cl对泥鳅胚胎均表现出明显的致畸毒性效应；随着[C8mim]Cl的浓度增加，泥鳅仔鱼死亡率上升，而100～225 mg·L-1的[C8mim]Cl对泥鳅仔鱼具有明显的致畸、致死作用。其中，[C8mim]Cl对孵出期泥鳅仔鱼的24 h、48 h的LC50分别为97.95和86.77 mg·L-1；而[C8mim]Cl对孵出后3 d泥鳅仔鱼的24 h、48 h的LC50分别为73.77和 40.98 mg·L-1。这与其他咪唑类离子液体对斑马鱼、大型蚤等其他水生生物具有生物毒性的研究成果一致[16-18]。由上可知，在一定的剂量内，[C8mim]Cl对泥鳅胚胎及仔鱼的发育有明显的致畸、致死作用，这为离子液体[C8mim]Cl的合理使用提供了理论依据。同时，本研究还发现，在神经胚和尾芽期，泥鳅胚胎对[C8mim]Cl的毒性影响较为敏感，其畸形率较其他时期明显增高。这可能是因为，神经胚期的胚胎正处于高度分化时期，尤其是胚头部等重要的神经系统在此时趋于形成，此时受到毒性影响，较易形成畸形个体；而尾芽期距孵出期比较短，其卵细胞膜的保护作用有所减弱。同时，本研究结果也说明，不同时期胚胎发育的敏感性有差异。另外，不同孵出期的泥鳅仔鱼对[C8mim]Cl的敏感性有差异，孵出后1 d进行处理的仔鱼比孵出后3 d进行处理的仔鱼的半致死浓度及安全浓度高。这说明，早期幼鱼(卵黄吸收期的仔鱼：孵出后1～3 d)，营养供给主要是靠卵黄提供，受外界的影响并不大；但随着发育的进行，幼鱼对外界的敏感性增强。该结果与姚纪花等[19]研究重金属对大鳞副泥鳅胚胎发育和仔鱼成活的影响结果基本一致。

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◆

Toxicityof[C8mim]CltoLoachEmbryonicandLarvalFish

Nan Ping, Wang Qiongqiong, Qi Meng, Zhai Shengna, Zhang Yuling, Yi Shuhong, Chang Zhongjie*

College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China

25 July 2013accepted11 November 2013

The toxic effect of chloride-1-helsinki-3-methylimidazolium chinook ([C8mim]Cl) to the embryos and larvae of loach (Misgurnus anguillicaudatus) were studied in this paper. The loaches were exposed to [C8mim]Cl from the beginning of different stages including the embryonic development of blastoderm, mid-gastrula, neurula and tail bud stage, and the larval period. The results showed that the hatching rate of loach embryos decreased and the abnormality of loach embryos increased with the increase of [C8mim]Cl concentration, and a significant dose-response relationship was observed. [C8mim]Cl showed significant toxicity to the loach embryonic development at the concentration between 67 and 150 mg·L-1. The mortality of loach larvae increased with the increase of [C8mim]Cl concentration, and the teratogenic and lethal effect of [C8mim]Cl on the loach larvae was observed at the concentration between 100 and 225 mg·L-1. The 24 h-LC50and 48 h-LC50of the newly hatched larvae were 97.95 and 86.77 mg·L-1, whereas the 24 h-LC50and 48 h-LC50of the 3-day-old larvae were 73.77 and 40.98 mg·L-1. This study provides some useful information for the rational use of [C8mim]Cl.

loach (Misgurnus anguillicaudatus); [C8mim]Cl; embryonic development; toxicity

国家自然科学基金(3071666)；河南师范大学青科基金(01046400067)；河南师范大学研究生创新项目(YL201313)；河南省自然科学基础与前沿(112300410275)

南平(1979-)，女，博士，讲师，研究方向为环境分子毒理学，E-mail: nanspring@sohu.com；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: changzhongjie@tom.com

10.7524/AJE.1673-5897.20130725001

南平，王琼琼，亓蒙，等. 离子液体[C8mim]Cl对泥鳅胚胎和仔鱼的毒性研究[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(2): 268-272

Nan P, Wang Q Q, Qi M, et al. Studies on toxicity effect of [C8mim]Cl to loach embryonic and larval fish [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 268-272 (in Chinese)

2013-07-25录用日期2013-11-11

1673-5897(2014)2-268-05

X171.5

A

常重杰(1965—)，男，博士，教授，主要研究方向为分子细胞毒理学，发表学术论文60余篇。