6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻的生长抑制

王摆，高士博,2，董颖，王笑月，周遵春,*

1. 辽宁省海洋水产科学研究院，大连 116023 2. 大连海洋大学，大连 116023

6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻的生长抑制

王摆1，高士博1,2，董颖1，王笑月1，周遵春1,*

1. 辽宁省海洋水产科学研究院，大连 116023 2. 大连海洋大学，大连 116023

海洋环境中苯系物污染主要来源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企业的废水排放。为探究苯系物对海洋微藻的毒性作用，选择球等鞭金藻和新月菱形藻作为受试生物，分别考察了苯、甲苯、乙基苯、邻-二甲苯、间-二甲苯和对-二甲苯6种苯系物对2种海洋微藻生长的影响。结果表明，在0.25～64.0 mg·L-1暴露浓度下，6种苯系物对2种微藻生长具有显著的抑制作用，随着暴露浓度的升高，抑制作用明显增强。苯、甲苯、乙基苯、邻-二甲苯、间-二甲苯、对-二甲苯对球等鞭金藻的24 h的半数效应浓度(24 h-EC50)分别为：17.07、12.88、7.58、0.55、0.36、0.27 mg·L-1；对新月菱形藻的24 h-EC50值分别为：1.03、0.68、0.46、0.40、0.42、0.38 mg·L-1。上述研究结果为确定苯系物海洋环境质量标准、保护海洋生态环境提供了基础数据。

苯系物；球等鞭金藻；新月菱形藻；生长抑制；毒性作用

苯系物(BTEX)是苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、乙基苯(Ethyl benzene)、二甲苯(Xylene)的统称[1]，作为全球生产和使用最广泛的50种化合物之一，已被美国环保署(USEPA)列为现阶段优先控制对象，其相关的环境标准较为完备。相比之下，苯系物列入我国集中式生活饮用水地表水源地特定检测项目，有关海洋环境中苯系物的环境标准尚属空白。

海洋环境中苯系物污染主要来源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企业的废水排放。石油中水溶性单环芳烃占89%，其中苯系物就占到87.6%[2]。2008年我国进口石油2亿吨的90%经海洋运输[3]。2010年大连“7.16溢油”[4]和2011年蓬莱“19-3溢油”事故中[5]，苯系物是一类重要的污染因子。近年来，我国对-二甲苯(PX)产能逐年升高，至2010年达到802.37万吨/年，而我国PX和对苯二甲酸(PTA)生产企业主要分布在沿海地区，2010年沿海地区的PTA总产能占全国总产能的72.6%[6]。PX和PTA工业废水主要成分包括苯、二甲苯等，是较难处理的石油化工废水。苯系物进入海洋环境主要存在于表层海水和沉积物中。表层海水中苯系物因挥发、光解、微生物的降解作用，其浓度通常在ng·L-1水平[7-8]。Cavalcante等[9]发现在港口表层海水苯系物浓度可以达到μg·L-1。海水中苯系物随着中颗粒物质沉降，在海洋沉积物中累积，致使海洋沉积物中苯系物含量可以达到mg·kg-1[10-12]。苯是已知的致癌物，甲苯和乙基苯具有致畸致突变作用，二甲苯具有致畸作用[1]。因此，亟需开展苯系物的海洋环境基准研究。根据美国环保署相关规定，环境基准的确定至少需要5～8种不同属生物毒理学数据，其中浮游植物毒理学数据是不可或缺的。

海洋微藻是海洋生态系统的初级生产者，约占海洋生物物种的40.86%[13]，是整个海洋食物链的基础，也是鱼、虾、贝的饵料生物，开展污染物对海洋微藻的毒性作用研究具有非常重要的意义[14]。大量研究表明海洋微藻对重金属、农药、有机污染物等较为敏感[15-17]，可作为有机污染物和无机污染物的指示生物[18]。许多国家已建立藻类毒性试验标准方法，广泛应用于污染物的毒性作用评价。江玉等[19]报道了甲苯对6种海洋微藻的毒性作用，而有关6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻的毒性作用研究尚未见报道。

依据苯系物在海洋环境中的分布特征和海洋浮游生物在海洋生态系统中的重要作用，本研究选择球等鞭金藻和新月菱形藻作为受试微藻，开展了苯、甲苯、乙基苯、邻-二甲苯、间-二甲苯和对-二甲苯6种苯系物对海洋微藻的毒性作用研究，以期为确定我国海洋环境苯系物的环境基准、保护海洋生态环境提供基础数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验用球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和新月菱形藻(Nitzschia closterium)取自辽宁省海洋水产科学研究院，藻种经活化后用于后续实验。2种微藻的培养基为f/2液体培养基，球等鞭金藻培养条件为：温度(25±0.2) ℃，盐度30.0，pH 7.8，光暗比为12 h∶12 h，白周期光照强度3 000 lux；新月菱形藻的培养条件为：温度(15±0.2) ℃，盐度30.0，pH 7.8，光暗比为12 h:12 h，白周期光照强度3 000 lux。

实验用苯、甲苯、乙基苯、邻-二甲苯、间-二甲苯、对-二甲苯及二甲基亚砜(DMSO)均为化学纯，购自中国国药有限公司。

1.2 实验方法

实验方法参照《化学品藻类生长抑制试验》(GB/T 21805—2008)[20]。苯的暴露浓度设置为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg·L-1，甲苯、乙基苯、邻-二甲苯、间-二甲苯、对-二甲苯的暴露浓度设置为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 mg·L-1，用二甲基亚砜配制6种苯系物各暴露浓度1 000倍的实验母液。在500 mL玻璃三角烧瓶中，用灭菌f/2液体培养基和苯系物的实验母液(200 μL)配制200 mL暴露溶液，同时设置空白对照组和助溶剂对照组，助溶剂浓度为0.1%(体积比)，每组设置3个平行样，2种藻的初始接种密度均为7.7×104cells·mL-1。暴露实验开始后，每天测1次藻液的细胞密度，试验重复1次。

藻液的细胞密度测量采用镜检法结合分光光度法，通过光谱扫描获得2种微藻的最佳吸收波长，用血球计数板镜检藻细胞密度，并在其最佳吸收波长处测定藻液的吸光值，绘制2种藻的细胞密度—吸光值标准曲线(见图1)。

1.3 数据统计与分析

6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻24 h、48 h、72 h-EC50值的计算方法参照化学品对藻类的生长抑制试验方法[20]。首先计算苯系物对微藻生长抑制率(GIR)，再进行生长抑制率与苯系物暴露浓度的回归分析，用插值法计算出24 h、48 h、72 h-EC50值。

GIR = (Ccont- CBTEX)/Ccont×100%

公式中：Ccont为对照组藻细胞密度，CBTEX为苯系物暴露组藻细胞密度。

采用SPSS 13.0软件(SPSS Inc.)对实验数据进行方差分析和回归分析。采用ANOVA方法分析苯系物暴露组与空白对照组之间的差异，p < 0.05表示差异显著；p < 0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论(Results and discussion)

通过方差分析发现助溶剂对照组与空白对照组中的球等鞭金藻、新月菱形藻的生长无显著差异，表明0.1%的二甲基亚砜对2种微藻的生长没有影响。以下分析6种苯系物对2种微藻生长的影响时，选取空白对照组作为参照。2.1 6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻的生长抑制

6种苯系物对球等鞭金藻的生长抑制率影响见图2，试验结果表明：1.0～32.0 mg·L-1的苯，1.0～64.0 mg·L-1的甲苯、乙基苯、0.25～64.0 mg·L-1的邻-二甲苯、间-二甲苯、对-二甲苯对球等鞭金藻的生长具有显著的抑制作用，随着暴露浓度的增加，生长抑制率升高，存在显著的剂量-效应正相关性。

6种苯系物对新月菱形藻的生长抑制率影响见图3，试验结果表明：1.0～32.0 mg·L-1苯，0.25～32.0 mg·L-1甲苯、乙基苯，间-二甲苯，0.25～16.0 mg·L-1邻-二甲苯、对-二甲苯对新月菱形藻的生长同样具有显著的抑制作用。随着暴露浓度的增加，生长抑制率升高，存在显著的剂量-效应正相关性。

图1 球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和新月菱形藻(Nitzschia closterium)的藻细胞密度—吸光值标准曲线Fig. 1 The standard curve of cell density of Isochrysis galbana and Nitzschia closterium to light absorption value

图2 6种苯系物对球等鞭金藻的生长抑制Fig. 2 Inhibitory effect of six kinds of BTEX on growth of I. galbana

图3 6种苯系物对新月菱形藻的生长抑制Fig. 3 Inhibitory effect of six kinds of BTEX on growth of N. closterium

2.2 6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻的EC50值 通过计算6种苯系物对2种微藻24 h、48 h、72 h-EC50值(见表1)发现：苯在3个时间点对球等鞭金藻生长具有显著抑制作用，其中48 h的抑制作用最强；苯在3个时间点对新月菱形藻生长具有显著抑制作用，其中，24 h的抑制作用最强。甲苯、乙苯、邻-二甲苯、间-二甲苯、对-二甲苯对2种微藻的抑制作用在24 h最强，随着暴露时间延长，对2种微藻的生长抑制作用减弱，72 h-EC50值显著升高。其中，对-二甲苯对球等鞭金藻的抑制作用下降最快。

表1 6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻的EC50值Table 1 EC50 value of six kinds of BTEX to I. galbana and N. closterium

通过对比6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻24 h、48 h、72 h-EC50值，发现苯、甲苯、乙基苯对新月菱形藻24 h-EC50值低于球等鞭金藻的，两者之间相差16.4～18.9倍左右，表明在24 h，苯、甲苯、乙基苯对新月菱形藻的生长抑制作用远大于对球等鞭金藻的；二甲苯的3种同分异构体对2种微藻的24 h-EC50值无显著差异。二甲苯对新月菱形藻72 h-EC50值要低于球等鞭金藻的。

目前，有关苯系物的生态毒理学研究大部分涉及陆生动物和淡水生物[1]。李崇磊等[21-22]等发现苯、甲苯、二甲苯混合暴露导致小鼠肺脏和脑组织的氧化损伤，造成小鼠学习记忆能力显著下降。范亚维等[23-24]开展了甲苯、乙苯、二甲苯对斑马鱼(Brachydanio rerio)、大型溞(Daphnia magna)和霍甫水丝蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)的毒性效应研究，结果表明，甲苯、乙苯和二甲苯对斑马鱼、大型溞和霍甫水丝蚓具有较强的毒性效应，并存在显著的剂量-效应正相关性。6种苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻的生长有显著抑制作用，存在显著的剂量-效应正相关性。江玉等[19]报道了4种芳烃对6种微藻的毒性作用，其中甲苯对小新月菱形藻(Nitzschia closterium minutissima)、甲藻(Zooxanthella microadriz tica)、三角褐指藻(Pheodactylum tricornutum)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、小球藻(Chlorella vulgaris)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)的72 h-EC50分别为：34.1、35.6、38.3、36.7、98.6、114.0 mg·L-1。本文发现甲苯对球等鞭金藻和新月菱形藻的72 h-EC50分别为37.66、20.87 mg·L-1。此外，6苯系物对球等鞭金藻和新月菱形藻的EC50值与其logKow值有较好的相关性，这与江玉等[19]的研究结论一致。

致谢：感谢辽宁省海洋水产科学研究院赫崇波研究员在文章修改中给予的帮助。

[1] 李学峰, 周启星. BTEX的环境质量标准研究进展[J]. 生态学杂志, 2011, 30(2): 369-375

Li X F, Zhou Q X. Environmental quality standard of BTEX: A review [J]. Chinese Journal of Ecology, 2011, 30(2): 369-375 (in Chinese)

[2] 白红妍, 韩彬, 陈军辉, 等. 静态顶空气相色谱-质谱联用法快速测定海水中13种苯系物[J]. 色谱, 2012, 30(5): 474-479

Bai H Y, Han B, Chen J H, et al. Rapid determination of benzene series in seawater by gas chromatography- mass spectrometry with static headspace extraction [J]. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30(5): 474-479 (in Chinese)

[3] Jiang Z B, Huang Y J, Xu X Q. Advance in the toxic effects of petroleum water accommodated fraction on marine plankton [J]. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(1): 8-15

[4] 李艳梅, 曾文炉, 余强, 等. 海洋溢油污染的生态与健康危害[J]. 生态毒理学报, 2011, 6(4): 345-351

Li Y M, Zeng W L, Yu Q, et al. Adverse effect of marine oil spills on human health and ecosystem: A Review [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2011, 6(4): 345-351 (in Chinese)

[5] 国家海洋局. 2011年中国海洋环境状况公报[EB/OL]. (2012-06-30) [2013-03-20]. http://www.soa.gov.cn/zwgk/hygb/zghyhjzlgb/201211/t20121107_5528.htm

[6] 屠庆华. 对我国对二甲苯产业发展的若干建议[J]. 化学工业, 2011, 29(7): 18-21

Tu Q H. Suggestions on China PX industry development [J]. Chemical Industry, 2011, 29(7): 18-21 (in Chinese)

[7] 吴金浩, 王摆, 王召会, 等. 海水中痕量苯系物的吹扫捕集/气相色谱质谱联用测定[J]. 分析测试学报, 2012, 31(12): 67-71

Wu J H, Wang B, Wang Z H, et al. Determination of BTEX in seawater by purge and trap gas chromatography-mass spectrometry [J]. Journal of Instrumental Analysis, 2012, 31(12): 67-71 (in Chinese)

[8] Chary N S, Fernandez-Alba A R. Determination of volatile organic compounds in drinking and environmental waters [J]. Trends in Analytical Chemistry, 2012, 32: 60-75

[9] Cavalcante R M, de Andrade M V F, Marins R V, et al. Development of a headspace-gas chromatography (HS-GC-PID-FID) method for the determination of VOCs in environmental aqueous matrices: Optimization, verification and elimination of matrix effect and VOC distribution on the Fortaleza Coast, Brazil [J]. Microchemical Journal, 2010, 96(2): 337-343

[10] 朱四喜, 周唯, 杨红丽, 等. 浙江舟山潮间带沉积物中二甲苯的检测[J]. 广东化工, 2010, 37(2): 125-127

Zhu S X, Zhou W, Yang L H, et al. Determination of xylene in interdial sediments in Zhoushan, Zhejiang Province [J]. Guangdong Chemical Industry, 2010, 37(2): 125-127 (in Chinese)

[11] 王树虎, 史向阳, 马万云, 等. 胶束电动毛细管色谱法测定海洋沉积物中的苯, 甲苯和二甲苯[J]. 分析测试学报, 2001, 18(1): 77-79

Wang S H, Shi X Y, Ma W Y, et al. Determination of benzene homologues in marine sediment by micellar electrokinetic capillary chromatography [J]. Journal of Instrumental Analysis, 2001, 18(1): 77-79 (in Chinese)

[12] Roose P, Dewwulf J, Brinkman U A Th. Measurement of volatile organic compounds in sediments of the Scheldt Estuary and the Southern North Sea [J]. Water Research, 2001, 35(6): 1478-1488

[13] 王明清, 迟晓元, 秦松, 等. 海洋微藻总脂含量和脂肪酸组成的测定[J]. 中国油脂, 2008, 33(11): 67-70

Wang Q M, Chi X Y, Qin S, et al. Total lipids and fatty acid composition of marine microalgae [J]. China Oils and Fats, 2008, 33(11): 67-70 (in Chinese)

[14] 汝少国, 李永祺. 十种有机磷农药对扁藻的毒性[J]. 环境科学学报, 1996, 16(3): 337-341

Ru S G, Li Y Q. Comparison Study on the toxicity of ten organophosphorus pesticides to Platymonas sp. [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 1996, 16(3): 337-341 (in Chinese)

[15] Levy J L, Stauber J L, Jolley D F. Sensitivity of marine microalgae to copper: The effect of biotic factors on copper adsorption and toxicity [J]. Science of the Total Environment, 2007, 387(1): 141-154

[16] Sundb ck K, Alsterberg C, Larson F. Effects of multiple stressors on marine shallow-water sediments: Response of microalgae and meiofauna to nutrient-toxicant exposure [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2010, 388(1): 39-50

[17] 唐学玺, 李永祺. 4种海洋微藻对久效磷的抗性与其抗氧化能力的相关性[J]. 海洋与湖沼, 2000, 31(4): 414-418

Tang X X, Li Y Q. Relationship between monocrotophos resistance and antioxidization in four species of marine microalgae [J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2000, 31(4): 414-418 (in Chinese)

[18] Torres M A, Barros M P, Campos S C G, et al. Biochemical biomarkers in algae and marine pollution: A review [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2008, 71(1): 1-15

[19] 江玉, 吴志宏, 韩秀荣, 等. 多环芳烃对海洋浮游植物的生物毒性研究[J]. 海洋科学, 2002, 26(1): 46-50

Jiang Y, Wu Z, Han X, et al. Toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) to marine algae [J]. Marine Science, 2002, 26(1): 46-50 (in Chinese)

[20] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. 中国国家标准化管理委员会. GB/T21805—2008化学品 藻类生长抑制试验[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008

[21] 李崇磊, 王凡, 刘薇, 等. 甲醛及苯系物混合暴露对小鼠肺脏的氧化损伤作用[J]. 生态毒理学报, 2012, 7(1): 87-92

Li C L, Wang F, Liu W, et al. Oxidative damage induced by formaldehyde and benzene series inhalation on mice lung [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2012, 7(1): 87-92 (in Chinese)

[22] 李崇磊, 王凡, 刘薇, 等. 挥发性有机物混合暴露对小鼠脑组织的氧化损伤及学习记忆能力的影响[J]. 生态毒理学报, 2012, 7(4): 367-372

Li C L, Wang F, Liu W, et al. Oxidative damage in brain tissue induced by exposure to mixture of volatile organic compounds and its effects on learning and memory abilities of mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2012, 7(4): 367-372 (in Chinese)

[23] 范亚维, 周启星, 王媛媛, 等. 水体BTEX 污染对大型溞和霍普水丝蚓的毒性效应及水环境安全评价[J]. 环境科学学报, 2009, 29(7): 1485-1490

Fan Y W, Zhou Q X, Wang Y Y, et al. Toxic effects of BTEX in water on Daphnia magna and Limnodrilus hoffmeisteri and safety assessment of the aquatic environment [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2009, 29(7): 1485-1490 (in Chinese)

[24] 范亚维, 周启星. 水体甲苯、乙苯和二甲苯对斑马鱼的毒性效应[J]. 生态毒理学报, 2009, 4(1): 136-141

Fan Y W, Zhou Q X. Toxic effects of toluene, ethylbenzene and xylene in waters on zebrafish Brachydanio rerio [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2009, 4(1): 136-141 (in Chinese)

◆

InhibitoryEffectofSixKindsofBTEXsonGrowthoftheChrysophyceaeIsochrysisgalbanaandtheDiatomNitzschiaclosterium

Wang Bai1, Gao Shibo1,2, Dong Ying1, Wang Xiaoyue1, Zhou Zunchun1,*

1. Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China 2. Dalian Ocean University, Dalian 116023, China

10 April 2013accepted25 June 2013

The marine pollution of benzene series (BTEXs), including benzene, toluene, ethyl benzene and xylene, is mainly from the marine oil spill and coastal petrochemical wastewater discharge. In order to reveal the toxic effect of BTEXs on marine microalgae, the chrysophyceae Isochrysis galbana and the diatom Nitzschia closterium were exposed to benzene, toluene, ethyl benzene, o-xylene, m-xylene and p-xylene, and their growth rates were detected. The results showed that the growth of I. galbana and N. closterium were inhibited dramatically by the BTEXs at the exposed concentration from 0.25 to 64.0 mg·L-1. The growth inhibition was enhanced with the concentration of BTEXs in well dose-effect manner. The 24 h-EC50of benzene, toluene, ethyl benzene, o-xylene, m-xylene and p-xylene to I. galbana was 17.07, 12.88, 7.58, 0.55, 0.36 and 0.27 mg·L-1. The 24 h-EC50of the corresponding BTEXs to N. closterium was 1.03, 0.68, 0.46, 0.40, 0.42 and 0.38 mg·L-1. The results presented in this study will provide basic data for establishing marine environmental quality criteria of BTEXs and protecting the marine ecological environment.

BTEX; Isochrysis galbana; Nitzschia closterium; growth inhibition; toxic effect

海洋公益性行业科研专项 (201205012-7)；大连市科学技术基金(2012J21DW029)

王摆(1981-)，男，助理研究员，研究方向为海洋生态毒理学，E-mail: wangbai1980@hotmail.com；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: zunchunz@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20130410001

王摆，高士博，董颖，等. 6种苯系物对海洋微藻：球等鞭金藻和新月菱形藻的生长抑制[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(2): 233-238

Wang B, Gao S B, Dong Y, et al. Growth Inhibition of Marine Microalgae the Chrysophyceae Isochrysis galbana and the Diatom Nitzschia closterium Caused by six kinds of BTEXs [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 233-238 (in Chinese)

2013-04-10录用日期2013-06-25

1673-5897(2014)2-233-06

X171.5

A

周遵春(1967—)，男，海洋生物学博士，研究员，主要研究方向海洋生物学，发表学术论文90余篇。