环境浓度水平的镍对不同生命阶段秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)体长与运动的刺激效应

陈晓雪，于振洋，尹大强

同济大学环境科学与工程学院 长江水环境教育部重点实验室，上海 200092

环境浓度水平的镍对不同生命阶段秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)体长与运动的刺激效应

陈晓雪，于振洋，尹大强*

同济大学环境科学与工程学院 长江水环境教育部重点实验室，上海 200092

毒物兴奋效应(hormesis)受到广泛关注。本文以秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)的L1(自虫卵开始培养10 h)、L3阶段(36 h)和年轻成虫阶段(72 h)为起始暴露阶段，进行环境浓度(3.18E-3、3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)水平的72 h 镍暴露试验，以体长与行为学指标为终点研究了不同生命阶段对毒物兴奋效应的影响。在所有暴露浓度下，镍对L1线虫的体长均表现出显著的刺激效应，3个较高浓度下(3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)的刺激效应相似，均表现为比空白多23.6%(P<0.05)的水平；L3线虫的体长在低浓度受到刺激，在高浓度受到抑制，表现为毒物兴奋效应；年轻成虫在所设4个浓度下均没有显著响应。在所有暴露浓度下，镍对L1线虫的身体弯曲运动无显著效应；镍对L3线虫的身体弯曲频率表现为刺激效应，并且该刺激效应随暴露浓度增加，先增加后减小，在3.18E-2 μmol·L-1表现出最大刺激效应，比空白多59.0%(P<0.05)；镍对年轻成虫的身体弯曲频率表现为比空白多17.7%～30.1%(P<0.05)的刺激效应，该刺激效应在不同浓度下不具有显著性差异。镍对L1线虫的倒退运动表现出显著的、随暴露浓度增加而增加的刺激效应，在3.18 μmol·L-1表现出最大刺激效应，比空白多187.0%(P<0.05)；镍对L3线虫的倒退运动在3.18 μmol·L-1下表现为比空白多22.7%(P<0.05)的刺激效应；镍对年轻成虫的倒退运动在较高的3个浓度下(3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)表现为比空白多46.7%～86.7%(P<0.05)的刺激效应。研究揭示环境浓度水平的镍暴露对不同生命阶段秀丽线虫的体长与运动具有不同程度的刺激效应。

镍；秀丽线虫；生命阶段；体长；运动；刺激效应

近年来，在低浓度暴露的毒性效应研究中，毒物兴奋效应受到越来越多的关注。毒物兴奋效应(hormesis)是指有害物质在高剂量时对生物体表现抑制作用，而在低剂量时却表现为刺激作用(一般表现为比空白增高30%～60%的水平)的两阶段性效应[1]。毒物兴奋效应，现在已经被认为是广泛存在、可重现的生物学效应。同时，毒物兴奋效应模型是一类不同于传统的渐近线或线性模型的新模型，这对现有的生态风险评价提出挑战，并将在未来风险评价中的标准设定等方面发挥更为重要的作用[2]。同时，毒物兴奋效应，尤其是其对生物学响应的刺激效应，具有通过改变生物适应性，进而影响生态系统稳定性的潜力[3]，毒物兴奋效应也受到生物学、生态学以及进化学的广泛关注[4-5]。

大量研究表明，处于不同生命阶段的生物体对有害物质具有不同的敏感性，导致同一种物质的生物效应差异显著。以重金属铅和汞为例，Xing等[6]研究了2种金属对L1阶段秀丽线虫神经元缺失的影响，发现低浓度铅的神经毒性比汞高；而Du等[7]则发现同样浓度下汞对L4阶段的线虫的神经毒性高于铅。再如Yu等[8]以L3阶段的线虫为受试生物，并以身体弯曲频率为指标，发现镉会造成线虫的弯曲频率明显下降；另有文献则报道镉对L4阶段的线虫身体弯曲频率影响不明显[9]。还有学者将青鳉鱼的卵暴露于双酚A 4～8 d后，发现双酚A导致鱼卵严重畸形[10]；而Zha等[11]发现双酚A不会使青鳉鱼幼鱼产生畸形。那么，毒物兴奋效应是否会因为受试生物生命阶段的不同而不同，尚需要直接的研究予以证实。

本文选择秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)作为受试生物。秀丽线虫易于实验室培养，对环境变化(温度、化学物质等)敏感，并且其不同生命阶段容易获得，因而广泛应用于毒性研究以及新型药品的探索中[8,12-13]。体长与运动是采用秀丽线虫进行毒性效应检测的常用指标。体长，体现的是线虫整体健康水平，广泛应用于重金属的毒性表征[8,14]。同时，秀丽线虫的运动，可体现线虫神经与肌肉的整体效应，广泛应用于包括重金属、药品等多种物质的毒性效应评价中[8,12-13,15]。

本文采用镍作为受试物质。镍是植物和某些动物的必需微量元素[16]，也是人类膳食的自然组成[17]。但是，过量的镍能够对生命有机体产生伤害。人类活动导致镍通过大气、水以及排泄物等多种方式排入环境中，甚至能够在有机体，尤其是植物中富集[18]。目前对镍的环境毒性研究以急性暴露的效应为主。镍对唐鱼(Tanichthys albonubes)的96 h半数致死浓度(LC50)为1.58E+2 μmol·L-1，属于中毒物质[19]。镍对秀丽线虫48 h暴露的LC50为4.36E+2 μmol·L-1[20]；在10.0 μmol·L-1镍中暴露12 h能够显著诱导秀丽线虫生殖细胞的凋亡[21]。此外，暴露于加标淡水沉积物(镍浓度≥3.05E+3 μmol·kg-1)会对无脊椎动物(例如Hyalella azteca等)的生长、繁殖与生存产生显著的负面影响[22]；Vangheluwe等[23]在此基础上，推荐镍在沉积物质量标准(reasonable worst case-sediment quality guidelines)中的限值为1.60E+3 μmol·kg-1。但是这些研究所采用的浓度范围，均远远高于环境以及食品中镍的浓度。例如，镍在香禾糯、大米中的含量为6.98、10.7 μmol·kg-1[24]。因此这些研究结果并不能够用于判断实际暴露条件下镍对有机体的生物学效应。

近期的研究表明，镍在环境介质(例如太湖的沉积物)中的存在浓度为μmol·kg-1的水平[25]。本文在此浓度下，设定多组镍浓度水平(3.18E-3、3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)，采用秀丽线虫的L1、L3阶段幼虫与年轻成虫(自虫卵开始培养的时间分别为10、36、72 h)为起始暴露阶段，进行72 h暴露试验，以体长与行为学指标为终点研究了不同生命阶段对毒物兴奋效应的影响。本研究旨在揭示在环境浓度水平的镍暴露下，不同生命阶段秀丽线虫的不同程度的毒物兴奋效应。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 主要仪器与试剂

仪器：蔡康XTL-3400C型体视显微镜(配视频捕获设备，上海蔡康光学仪器有限公司)。采用可溶性镍盐硝酸镍(Ni(NO3)2·6H2O)作为暴露体系中镍的来源，购自上海恒信化学试剂有限公司，纯度>98.0%。采用钾溶液(1 L蒸馏水中，3.00 g氯化钠，2.36 g氯化钾；在121 ℃、0.105 MPa灭菌20 min)进行溶解[26]。

1.2 秀丽线虫的培养

本研究所采用的秀丽线虫(C. elegans)，由上海复旦大学发育生物学研究所惠赠。秀丽线虫采用覆有尿嘧啶缺陷型大肠杆菌(E. coli OP50)的线虫生长培养基(nematode growth media, NGM)[27]，在22 ℃条件下进行培养；E. coli采用Luria-Bertani培养基在37 ℃恒温摇床中120 r·min-1进行培养[28]。

1.3 秀丽线虫的同步化及不同生命阶段的获得

同步化：秀丽线虫正常培养一段时间后，采用新配制的碱裂解液(Clorox)杀死成虫，获得对碱裂解液具有抵抗力的虫卵[29]，将同步化后得到的卵液接种到覆有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，22 ℃恒温培养箱中分别培养10、36、72 h后，得到相对应L1、L3阶段幼虫及年轻成虫阶段的线虫[30]。

1.4 暴露试验

采用24孔板进行不同生命阶段线虫的镍暴露试验，设定4个镍暴露浓度组(3.18E-3、3.18E-2、3.18E-1和3.18 μmol·L-1)和1个空白组；每组占用4孔作为平行。染毒组的每孔中，含有500 μL毒液(含不同浓度梯度的镍)、300 μL含有食物的钾溶液以及200 μL不同生命阶段的秀丽线虫；空白组的每孔中，加入500 μL钾溶液、300 μL含有食物的钾溶液以及200 μL相应生命阶段的秀丽线虫。线虫经过72 h暴露后，将24孔板中的线虫转移到没有大肠杆菌OP50覆盖的NGM培养基上，进行相关指标的检测，得到镍对线虫的毒性效应。

1.5 指标的测定

1.5.1 体长的测定

采用体式显微镜配备的图像捕捉设备对暴露后的秀丽线虫进行拍照并保存，然后使用上海蔡康光学仪器有限公司发行的二维测量软件(DS-3000)进行秀丽线虫体长的测定。具体测定步骤为：沿秀丽线虫身体中线从头部至尾部、再从尾部至头部划折线，折线长度的一半即为秀丽线虫的体长[31]。

1.5.2 行为指标的测定

采用体式显微镜配备的视频捕捉设备对暴露后的秀丽线虫的运动进行录像并保存，然后遵循Wang等[9]的研究方法，进行身体弯曲与倒退运动的检测。身体弯曲(body bending)定义为：如果设定秀丽线虫的运动方向为x轴方向，则其咽后部球形部分在y轴方向上的运动方向的一次改变，即为一次身体弯曲。倒退运动(reverse movement)：任何从前向后的运动的改变就计数为一次逆向运动；Omega运动也作为逆向运动的一种。Omega运动：秀丽线虫的身体通过头部向尾部的弯曲、形成类似希腊字母Omega(Ω)的形状而完成180°转弯，从而使得其运动方向反向的转向。

1.6 数据处理方法

采用软件Microsoft Office Excel和Origin Pro 7.5软件对数据进行处理，包括正态性检验、平均值计算、显著性差异分析等内容。本研究所采用的数据表达方式在未经特殊说明的情况下均采用“相对于空白组秀丽线虫相同指标的百分比(相对空白百分比/%)”的形式表达，图中数据均采用平均值±标准差的方式表达[13]。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 环境浓度水平的镍对不同生命阶段秀丽线虫体长的效应

环境浓度水平的镍对不同生命阶段秀丽线虫体长的效应如图1所示。在暴露浓度下，镍没有显著抑制L1线虫的体长，相反，表现出显著的刺激效应，镍在3.18E-2 μmol·L-1浓度下表现出对线虫体长的最大刺激效应，比空白多23.6%(P<0.05)。镍对L3线虫的体长表现出低浓度刺激、高浓度抑制的效应，镍在3.18E-2 μmol·L-1浓度下产生的最大刺激效应比空白多10.9%(P<0.05)，在3.18 μmol·L-1浓度下产生的最大抑制效应比空白小15.5%(P<0.05)。镍在所选浓度范围内对年轻成虫体长没有产生显著影响。

图1 环境浓度水平的镍暴露对不同 生命阶段秀丽线虫体长的效应Fig. 1 Effects of nickel at environmental concentration on body length of nematodes (Caenorhabditis elegans) at different life stages

从结果中可以看出，镍的刺激效应在L1秀丽线虫中表现最明显，L3阶段次之，在年轻成虫中没有表现；与此同时，高浓度镍对L3秀丽线虫具有抑制效应，而对L1和年轻成虫没有表现出抑制效应，这说明镍对L1秀丽线虫表现为显著的毒物兴奋效应，而对L3线虫表现为显著的毒性效应。在Wang等[32]用硫酸镍进行世代毒性的研究中，镍在2.5 μmol·L-1浓度下也显著刺激了秀丽线虫体长的增加。尽管该研究中未对所采用秀丽线虫的生命阶段进行界定，但是其研究结果与本文中镍在3.18 μmol·L-1条件下刺激L1秀丽线虫体长增加的结果相似。然而，不同生命阶段对毒物兴奋效应的影响机制还不清楚，需要进一步探索。

2.2 环境浓度水平的镍对不同生命阶段秀丽线虫运动的效应

环境浓度水平的镍对不同生命阶段秀丽线虫身体弯曲频率的效应如图2所示。在暴露浓度下，镍对L1线虫的身体弯曲没有显著影响，镍对L3线虫身体弯曲表现为刺激效应，而且这种刺激效应随着镍浓度的增加，先增加后减小，在3.18E-02 μmol·L-1条件下表现为比空白多59.0%(P<0.05)的最大刺激水平。镍对年轻成虫的身体弯曲表现为一定的刺激效应，该刺激效应在不同浓度之间不具有显著性的差异，维持在比空白多17.7%～30.1%(P<0.05)的水平。

图2 环境浓度水平的镍对不同生命阶段 秀丽线虫身体弯曲频率的效应Fig. 2 Effects of nickel at environmental concentration on body bending frequency of nematodes (Caenorhabditis elegans) at different life stages

环境浓度水平的镍对不同生命阶段秀丽线虫倒退运动的效应如图3所示。在暴露浓度下，镍对L1线虫的倒退运动产生了显著的刺激效应，而且该刺激效应随着暴露浓度的增加而增加，镍在3.18 μmol·L-1暴露条件下表现出的最大刺激效应比空白多187.0%(P<0.05)。镍在对较低的3个镍浓度(3.18E-03、3.18E-02、3.18E-01 μmol·L-1)条件下对L3线虫的倒退运动无显著影响，但是在最大暴露浓度(3.18 μmol·L-1)下产生了为比空白多22.7%(P<0.05)的刺激效应。较高的3个镍浓度(3.18E-02、3.18E-01、3.18 μmol·L-1)对年轻成虫的倒退运动表现为一定的刺激效应，但是该刺激效应在3个浓度间不具有显著性的差异，表现为比空白多46.7%～86.7%(P<0.05)的水平。在每一个暴露浓度中，不同生命阶段秀丽线虫倒退运动的顺序为：L1 > 年轻成虫 ≥ L3。

图3 环境浓度水平的镍对不同生命 阶段秀丽线虫倒退运动的效应Fig. 3 Effects of nickel at environmental concentration on reverse movement of nematodes (Caenorhabditis elegans) at different life stages

秀丽线虫的运动轨迹表现为正弦曲线的形状，该运动模式通过其体内神经突触对背、腹部体壁肌肉的控制完成[33-34]，并且这种运动模式能够被多种因素改变，例如突变[35]，饮食、产卵与交配等自然行为以及来自于环境的刺激等。因此，本研究中发现镍对行为学指标的抑制效应可能源自于镍对秀丽线虫神经系统的影响，而且这种效应与生命阶段紧密相关。Xing等[6]采用不同生命阶段的秀丽线虫研究铅和汞的神经毒性时，已经发现了神经毒性与生命阶段的相关性，受试物质对L1～L3线虫的神经抑制效应高于L4与年轻成虫。该研究并没有发现刺激效应，可能原因不仅与不同物质的毒性机制有关，而且可能与诸多不同暴露条件的设定有关，例如Xing等[6]采用2.5～20 μmol·L-1的浓度范围、在无食物条件下进行了6 h的暴露，而本文采用的最高浓度为3.18 μmol·L-1、在有食物条件下进行了72 h的暴露。

镍在3.18E-3 μmol·L-1(0.187 mg·L-1)浓度下对不同生命阶段线虫体长和运动产生了不同程度的毒物兴奋效应，尤其值得注意的是其中的刺激效应。毒物兴奋效应的特殊性使其备受争议。一方面，毒物兴奋效应在细菌、植物、动物甚至人类中具有很高的保守性，这些发现使得这种特殊的效应在疾病的临床治疗、农业/养殖业的快速发展等领域获得重要应用[2]。另一方面，毒物兴奋效应具有通过改变生物适应性，进而影响生态系统稳定性的潜力[3]。因而，需要在综合考虑受试物质、受试生物及其生命阶段、暴露时间(甚至暴露世代)等多种因素的基础上，对毒物兴奋效应的产生机理展开更为深入、全面、合理的研究[36]。

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StimulationsofNickelatEnvironmentalConcentrationsonLocomotionandGrowthofCaenorhabditiselegansatDifferentLifeStages

Chen Xiaoxue, Yu Zhenyang, Yin Daqiang*

Key Laboratory of Yangtze River Water Environment of Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

18 September 2013accepted5 December 2013

Hormesis is receiving wide attentions. L1 (cultured for 10 h since synchronized eggs), L3 larvae (36 h) and young adult (72 h) of Caenorhabditis elegans were exposed to 3.18E-3, 3.18E-2, 3.18E-1 and 3.18 μmol·L-1of nickel for 72 h to study the hormetic responses of nematodes at different life stages using growth and behavior as endpoints. The body length of L1 nematodes after exposure was significantly stimulated, and the stimulation levels were 23.6% higher than the control (P<0.05), which were similar at the three higher concentrations (3.18E-2, 3.18E-1 and 3.18 μmol·L-1). The body length of L3 nematodes was stimulated at low concentration and inhibited at high concentration, indicating hormetic effects. The body length of young adults was not significantly influenced after exposure to the four concentrations of nickel. The body bending of L1 nematodes was not affected by nickel exposure. The body bending of L3 nematodes was stimulated, and the stimulated levels firstly increased to the maximum of 59.0% higher than the control (P<0.05) at 3.18E-2 μmol·L-1and then deceased with increasing concentration. The body bending of young adult nematodes was stimulated at the levels of 17.7%-30.1% higher than the control (P<0.05), and the stimulation levels had no significant differences among the four exposure concentrations. The reversal movement of L1 nematodes showed significant and concentration-dependent stimulations by nickel exposure, with a maximum of 187.0% higher than the control (P<0.05) at 3.18 μmol·L-1. The reversal movement of L3 nematodes was stimulated at the level of 22.7% higher than the control (P<0.05) at 3.18 μmol·L-1. The reversal movement of young adults increased by 46.7%-86.7% than the control (P<0.05) at the three higher concentrations (3.18E-2, 3.18E-1 and 3.18 μmol·L-1). The body length and l℃omotion movement in nematodes at different life stages showed different degrees of stimulations at environmental concentrations of nickel.

nickel; Caenorhabditis elegans; life stage; body length; l℃omotion; stimulation

国家自然科学基金(21307095)，中国博士后科学基金(2013M540390)

陈晓雪(1987-)，女，学士，研究方向为毒理学，E-mail: cxxxil@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: yindq@tongji.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130918001

陈晓雪，于振洋，尹大强. 环境浓度水平的镍对不同生命阶段秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)体长与运动的刺激效应[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(2): 299-305

Chen X X, Yu Z Y, Yin D Q. Stimulations of nickel at environmental concentrations on locomotion and growth of Caenorhabditis elegans at different life stages [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 299-305 (in Chinese)

2013-09-18录用日期2013-12-05

1673-5897(2014)2-299-07

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尹大强(1962—)，男，博士，教授，主要从事污染物生态效应与毒性机理、化学品生态与健康风险的研究。