大蒜素对诱癌Wister鼠模型腺窝异常病灶产生的影响分析

黄鉴，珠珠，李文亮，周锐泽，任俊宇，董坚

（昆明医科大学第一附属医院 肿瘤科，云南 昆明 650032）

大蒜素对诱癌Wister鼠模型腺窝异常病灶产生的影响分析

黄鉴，珠珠，李文亮，周锐泽，任俊宇，董坚Δ

（昆明医科大学第一附属医院 肿瘤科，云南 昆明 650032）

目的探讨大蒜素对Wister鼠模型中腺窝异常病灶（abnormal crypt focus，ACF）的影响。方法60只Wister大鼠，按照20 mg/kg皮下注射二甲肼（dimethylhydrazine，DMH），每周1次，连续喂养18周。随机分为大蒜素组和非大蒜素组，将每组分为3批，分别在开始用药后8周、16周与24周分别处死大鼠，每批10只，美兰染色后镜片下观察大肠组织。结果大肠被均等分为10份进行观察，ACF大部分分布于中段和远端，大约在50%～80%处。非大蒜素组的基本情况：8 周 ACF平均（63．97±1．22）个/只，16 周 ACF平均（83．97±1．13）个/只，24 周 ACF平均（69．33±2．01）个/只；大蒜素组的基本情况：8 周 ACF平均（9．4±1．12）个/只，16 周 ACF平均（7．17±1．33）个/只，24 周 ACF平均（4．97±1．23）个/只。非大蒜素组 ACF的发生情况显著高于大蒜素组，2组ACF发生率和数量差异有统计学意义（χ2=15．88，P＜0．01）。结论大蒜素可以明显降低Wister大鼠腺窝异常病灶的发生数量，在一定程度上降低直肠癌的发生率，起到预防的作用。

大蒜素；Wister鼠模型；腺窝异常病灶；直肠癌

1.2 研究方法 制备Wister大鼠的异常腺窝病灶的模型：将购买的60只wister大鼠给予二甲肼处理，按照20 mg/kg的剂量进行皮下注射，每周1次，连续持续18周，将所有的模型大鼠随机分为大蒜素组和非大蒜素组，大蒜素组大鼠在第一次给予二甲肼处理后，按每天10 mg/kg体重给予大蒜素，灌肠，直至ACF模型大鼠被处死。

组织标本的制备：在指定的时间采用脱颈椎的方法处死大鼠，取大鼠的直肠，用预冷的PBS洗干净，将肠组织沿肠系膜纵向切开，然后固定于10%的多聚甲醛溶液中，然后放置于0.2%的亚甲蓝溶液浸泡10～20 min，将染色后的肠组织转移至载玻片上，通过显微镜进行观察ACF的数目[4]。

1.3 研究指标 判断异常腺窝病灶的标准：镜下见腺管扩大，上皮层增厚，腺管之间间距增大以及不规则的管腔和镜下可见的轻微的隆起。肿瘤的标准分型按照Sunter标准。观察方法：大肠被分为均等的10份进行观察。从盲肠端开始为0，分别记为大肠长度的 10%(1%～10%)、20%(11%～20%)、30%(21%～30%)、40%(31%～40%)、50%(41%～50%) 、60%(51%～60%)、70%(61%～70%)、80%(71%～80%)、90%(81%～90%)、100%(91%～100%)。

1.4 统计学方法 用SPSS 13.0统计分析软件进行，计量资料以“±s”来表示，对于服从正态分布，方差齐性的资料采用方差分析；计数资料采用秩和检验。检验标准取α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜素组和非大蒜素组肿瘤的形成情况 2组在8 w时均未见肿瘤的形成，在第16 w时非大蒜素组在处死的10只里有2只在30%和40%处有肿瘤的形成，病理切片镜下观察为均为高分化腺癌，在第24 w时非大蒜素组中有8只鼠形成了肿瘤，其中有2只在在10%～20%处形成了低分化的粘液性的腺癌，其他6只在距盲肠50%～80%处形成了高分化性的腺癌；大蒜素组在第24 w处死的10只鼠中仅有1只，在距盲肠远端（60%～80%）形成了高分化性的腺癌见图1。

图1 2组肿瘤形成类型Fig.1 Types of tumor formation in two groups

2.2 大蒜素组和非大蒜素组腺窝异常病灶（ACF）的形成情况 大肠被均等分为10份进行观察，ACF大部分分布于中段和远端，大约在50%～80%处。非大蒜素组的基本情况：8周ACF平均（63.97±1.22）个/只，16周 ACF 平均（83.97±1.13）个/只，24周ACF平均（69.33±2.01）个/只；大蒜素组的基本情况：8周ACF平均（9.4±1.12）个/只，16周 ACF平均（7.17±1.33）个/只，24周ACF平均（4.97±1.23）个/只。根据基本的ACF的发生情况非大蒜素组明显的高于大蒜素组，经过统计学检验ACF的发生率以及数量在2组之间的差异具有统计学意义（χ2=15.88，P＜0.01，见表1），说明大蒜素可以有效的预防腺窝异常病灶的发生。

表1 ACF在2组的分布情况Tab.1 Distribution of ACF in two groups

3 讨论

直肠癌是临床上常见的消化道的恶性肿瘤，近几年发病率逐年上升，死亡率也随之升高，严重影响患者的健康和生命，早期对于直肠癌患者进行干预对于患者的治疗具有重要意义[5]。腺窝异常病灶是1987年首次被发现[6]，在制作小鼠的结肠癌模型时经过亚甲蓝染色后在光镜下呈现单个或者多个比正常腺窝增大增深的异常腺窝。后来对对异常腺窝病灶进行定义就是指在啮齿类动物或者人类的结直肠组织中在光镜下观察发现的单独出现或者呈簇出现的异常的腺窝，与正常的腺窝组织不同，主要表现为使用亚甲蓝染色后腺管的显色比较深、腺窝异常扩大、面积增大、上皮层增厚、突出于上皮表面呈隆起状、腺管开口可以呈现不同的形状如锯齿、椭圆和裂隙等[7]。由于肠组织的异常腺窝病灶出现较早，可以作为直肠癌患者早期诊断的一项指标[8]。有研究表明在人类的直肠癌患者的检出率很高，在健康人的检出率为15%～77%，而在结直肠肿瘤患者中的检出率可达到100%，而且随着结直肠癌患者病程的进展，异常腺窝病灶的的数目随之增加，当使用叶酸、维生素等抗癌药物后，异常腺窝病灶的数目相应的减少，当给予吸烟、喝酒等于消化道肿瘤相关的刺激因子诱导后，患者的异常腺窝病灶增加，可以提示异常腺窝病灶对于结直肠癌患者的诊断、治疗、及预后评价具有一定的指导价值。

大蒜抑制被认为是具有疾病预防和治疗作用的食物，大蒜素是其主要成分[9]，大蒜素是一种具有多项生物功能的物质，主要是来自大蒜的鳞型球茎中提取的油状液体，具有可挥发性，是目前研究的比较热的天然抗肿瘤的物质之一[10]，其有效成为为有机硫化物，主要包括二烯丙基一硫化物、二烯丙基二硫化物和二烯丙基三硫化物[11]。很多报道显示大蒜素具有抗肿瘤[12]、抗细胞凋亡、抗细菌真菌感染、提高机体免疫力等作用.目前研究比较肯定的是大蒜素在前列腺癌中的作用，显示大蒜素能明显减轻前列腺癌模型小鼠的疾病进程，改善其病理状况[13]。同时其与其他化疗药物联合给药能促进化疗药物的抑制肿瘤细胞增殖作用[14]。对于消化道肿瘤中大蒜素的应用目前研究比较少，而且大部分研究出现了很多矛盾的地方，尤其是大蒜素不同的成分对于异常腺窝病灶的影响，有的研究显示二烯丙基一硫化物能减少异常腺窝病灶的生成，有的则报道二烯丙基一硫化物不仅不会减少异常腺窝病灶的数目而且会增加，也有研究显示二烯丙基二硫化物可以减少异常腺窝的生成，我们认为这种矛盾结果的提出可以能与大蒜素不同的程度对于直肠癌的作用不同而导致的。

在我们的研究中我们使用二甲肼诱导wister大鼠的直肠癌模型，观察组患者在同时给予大蒜素处理，对照组大鼠不给于大蒜素处理，结果显示2组大鼠在8周时均未见肿瘤形成，大蒜素组24周处死的10只老鼠中只有1只出现肿瘤，而非大蒜素组24周处死的10只老鼠中有8只出现了肿瘤，提示大蒜素可以延缓肿瘤的发生。而且分别在8周、16周、24周处死的老鼠中非大蒜素组的老鼠的异常腺窝病灶的数目明显高于大蒜素组，提示大蒜素对已直肠中异常腺窝病灶的产生具有重要作用，可以减少其产生，对于肠道异常腺窝病灶的出现具有预防作用，提示大蒜素可以作为一种预防直肠癌的癌前病变有一定的预防作用[15]。

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Effect of allicin on abnormal crypt focus production in carcinogenesis Wister rat model

HUANG Jian，ZHU Zhu，LI Wen-liang，ZHOU Rui-ze，REN Jun-yu，DONG JianΔ

(Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, China)

ObjectiveTo study the influence of the allicin on abnormal crypt focus(ACF). in Wister rat model.Methods60 Wister rats were subcutaneous injected by dimethylhydrazine (DMH), according to 20 mg/kg weight, once a week, feeding 18 weeks continuously. All of the rats were randomly divided into allicin group and non-allicin group, each group was divided into three groups evenly, and put to death at 8, 16 and 24 weeks after medication separately. Large intestines were observed after dyeing.ResultsLarge intestines were divided into ten equally, and all pieces were observed. ACF were almostly distributed in the middle and distal of the large intestines, about in 50%-80%.The basic situation of non-allicin group was as follows: ACF at 8 weeks was 63.97±1.22 on average per each, 16 weeks was 83.97±1.13, 24 weeks was 69.33±2.01. The basic situation of allicin group: ACF at 8 weeks was 9.4±1.12 on average per each , 16 weeks was 7.17±1.33, 24 weeks was 4.97±1.23.The occurrence of ACF in nonallicin group was higher than allicin group, the differences of incidence rate and number of ACF between two groups was significant (χ2= 15.88，P＜0.01).ConclusionAllicin can significantly reduce the number of ACF in Wister rats, lower the incidence of colorectal cancer, has prevention effect.

allicin; Wister rat model; abnormal crypt focus; colorectal cancer

R 735．3

A

1005-1678(2014)02-0065-03

腺窝异常病灶是在诱导啮齿动物直肠癌模型中发现的有别于正常腺管的现象，如腺管扩大、上皮组织较正常厚、腺管之间的距离扩大及不规则的突起[1]，常常将异常腺窝病灶是肠癌早期最早发现的粘膜病变，可以是单个的病灶，也可以是聚集在一起的多个病灶，异常腺窝病灶的数目和状况对于肿瘤发生发展具有一定的提示作用，也可以作为治疗效果的一个指标[2]。大蒜素是大蒜的主要成分，具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、提高免疫力等多方面功能[3].在本研究中我们通过二甲肼诱导wister大鼠肠癌，探讨使用大蒜素进行处理后对腺窝异常病灶产生的影响。

1 资料与方法

1.1 Wister鼠模型的构建和用药 60只断乳的6周龄雄性大鼠，体重100～140 g，由四川大学动物中心购得(许可证号：2008A046)。饲养于SPF环境（即无特定病原体动物是不携带潜在感染或条件致病菌），所有的大鼠都以标准固定的饲料，自由饮水，光照时间、湿度、室温分别为12 h、45%、24.5℃，动物都分笼饲养。所用致结肠癌物为二甲肼（DMH，购自sigma公司），临用前溶于0.9%的生理盐水（含0.1%DMSO）中，配制成8 mg/mL DMH的溶液，浓度大约2%，再用碳酸氢钠调至pH 6.5左右备用，用药标准为20 mg/kg。

黄鉴，男，博士在读，主治医师，研究方向：结直肠癌规范化治疗，E-mail：jhwang921@gmail.com；董坚，通信作者，女，博士，教授，主任医师，研究方向：肿瘤生物治疗和干细胞转化研究学，E-mail：dongjian18@yahoo.com。