人凝血酶原复合物中凝血因子活性测定的影响因素研究

田倩 ，曹海军 ，曹雅，何泽超，李长清Δ

（1.四川大学 化学工程学院，四川 成都 610065；2.中国医学科学院 输血研究所，四川 成都 610052）

人凝血酶原复合物中凝血因子活性测定的影响因素研究

田倩1，曹海军2，曹雅1，何泽超1，李长清2Δ

（1.四川大学 化学工程学院，四川 成都 610065；2.中国医学科学院 输血研究所，四川 成都 610052）

目的探讨几种因素对人凝血酶原复合物（prothrombin complex concentrates，PCC）中凝血因子活性测定的影响。方法参照《中国药典》（2010版），采用不同样品前处理、不同稀释剂、不同盐离子浓度制品、不同测定标准品及不同厂家试剂分析其对PCC中凝血因子II、VII、IX、X活性测定结果的影响。结果PCC加入硫酸鱼精蛋白，凝血因子II、VII、X活性降低，凝血因子IX活性升高；样品37℃温浴15 min与否，4种因子活性测定统计显示无显著差异。乏浆、生理盐水、蒸馏水及配套稀释液稀释对4种因子活性测定结果影响统计显示有显著差异（P＜0．05）；含1mol/L氯化钠的制品，凝血因子II、X活性测定结果显著低于含0．25 mol/L氯化钠制品（P＜0．05），而凝血因子VII、IX无统计学差异。不同标准品，测定的因子活性均不同。不同厂家试剂对4种凝血因子测定结果统计显示有显著差异（P=0．00）。结论PCC前处理条件、测定稀释剂、制品所含的盐离子浓度、测定标准品及不同厂家的试剂均影响其凝血因子的活性测定，在检测过程中应予重视。

凝血酶原复合物；硫酸鱼精蛋白；稀释剂；盐离子浓度；标准品

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 PCC（华兰公司，批号：201205025）；Coagulation Factor II、VII、IX、X Deficient Plasma（SIEMENS公司，批号：503620 B、500737 B、500870、504001A）；Thromborel S（SIEMENS 公司，批号：545503）；Dade Owren’s Veronal Buffer（SIEMENS 公司，批号：547005）；Actin（SIEMENS公司，批号：547174 A）；氯化钙溶液（SIEMENS公司，批号：539462 A）；FII、FVII、FIX、FX 活性检测试剂盒（成都协和技术有限责任公司，批号：20130702）；标准品1（SIEMENS公司，批号：503228 B）；标准品 2（NIBSC，批号：SSCLOT 4）；标准品3（成都协和技术有限责任公司，批号：2013070）；酸鱼精蛋白（sigma p 4380），其余试剂为国产分析纯。全自动血凝仪（CA-1500，Sysmex 公司）；恒温水浴箱（HH-W 600，金坛市医疗仪器厂）；纯水仪（Milli-Q Advantage，Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 硫酸鱼精蛋白对PCC制品4种凝血因子测定结果的影响 根据中国药典（2010版）[11]，用相应因子的乏浆（FIX为生理盐水稀释）稀释PCC制品。配制浓度0.2 mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液，按照欧洲药典[10]规定肝素钠在PCC中最大含量中和肝素钠。分3种情况对PCC样品进行处理，样本1加入一定浓度的硫酸鱼精蛋白溶液，混匀立即测因子活性；样本2不加硫酸鱼精蛋白溶液，样本3加入相同浓度的硫酸鱼精蛋白溶液，样本2和样本3均在37℃温浴15 min。采用全自动凝血仪测定4种凝血因子活性。

1.2.2 稀释剂对PCC制品4种凝血因子测定结果的影响PCC制品分别用相应乏浆（FIX用生理盐水）、配套稀释液、纯水稀释PCC制品，按照中国药典（2010版）[11]要求处理样品后，在全自动凝血仪上测出3种稀释条件下的4种因子的活性。

1.2.3 不同盐离子浓度对PCC制品4种凝血因子测定结果的影响 用相应的乏浆（凝血因子II、VII、X）和生理盐水（凝血因子IX）将PCC制品稀释到一定浓度，加入NaCl，制备盐离子浓度分别为1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L 3种浓度梯度PCC溶液，同时使其待测PCC制品中相应的凝血因子浓度满足中国药典，检测3种盐离子浓度中4种凝血因子活性。

1.2.4 不同标准品对PCC制品四种凝血因子测定结果的影响 分别用3种标准品做出标准曲线，样品处理方法按照中国药典（2010版）[11]，测出3种标准曲线下PCC溶液中4种因子活性。

1.2.5 不同厂家试剂对PCC制品四种凝血因子测定结果的影响 PCC制品处理按照中国药典（2010版）[11]，分别用2套试剂测出样品中4种凝血因子活性。

1.2.6 统计学方法 凝血仪测得样品的凝固时间，代入标准曲线，得到样品因子的百分活性，乘以稀释倍数和标准品的因子活性，即为样品的因子活性。采用SPSS 17.0进行统计学分析，对每种因子3种情况下的18个数据进行单因素方差分析。两公司试剂检测结果采用配对t检验进行分析。

2 结果

2.1 硫酸鱼精蛋白对FII、FVII、FIX、FX活性测定的影响SIEMENS公司试剂测出的因子活性结果见图1。PCC制品加硫酸鱼精蛋白后FII、FVII、FX的活性较不加偏低，但差异无统计学意义。加硫酸鱼精蛋白后，37℃温浴15 min与否对4种凝血因子活性无显著影响。PCC制品加入硫酸鱼精蛋白后FIX活性测定高于不加，加硫酸鱼精蛋白后立即测FIX活性高于加硫酸鱼精蛋白且37℃温浴15 min，但差异均无统计学意义。

图1 硫酸鱼精蛋白对4种凝血因子活性的影响*P＜0.05，**P＜0.01，与加硫酸鱼精蛋白相比Fig.1 The influence of protamine sulfate on activities of four coagulation factors in three samples*P＜0.05，**P＜0.01， compared with adding protamine sulfate

2.2 稀释液种类的不同对FII、FVII、FIX、FX活性测定的影响 SIEMENS公司试剂测定结果见图2。测定结果显示配套稀释液稀释均低于超纯水稀释，2组FII与FVII差异显著，FIX与FX差异不显著。乏浆稀释PCC后，外源因子FII，FVI，FX活性测定结果显示与其它2种稀释液比较有显著性差异（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。内源因子FIX生理盐水稀释后测出的因子活性高于其他2种稀释液情况，但与超纯水稀释差异不显著。

图2 稀释液对4种凝血因子活性测定的影响*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与生理盐水组对比Fig.2 The influence of dilution buffer on activities of four coagulation factors*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001， compared with normal saline group

2.3 PCC中不同盐离子浓度对FII、FVII、FIX、FX活性测定的影响 SIEMENS试剂盒对3种不同盐离子浓度的PCC测定4种因子活性结果见图3。从图3中可见FIX与FVII在3种盐离子浓度下测出的因子活性均无显著性差异，而FII与FX在低盐离子浓度下测出的因子活性高于高盐离子浓度，通过均值分析显示差异性显著（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

图3 盐离子浓度对4种凝血因子活性测定的影响*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与 0.25 mol/L NaCl组相比Fig.3 The influence of salt concentration on activities of four coagulation factors*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001， compared with 0.25 mol/L NaCl group

2.4 标准品的不同对FII、FVII、FIX、FX活性测定的影响 用3种不同的标准品做出标准曲线，测定4种因子活性（见图4）。凝血因子FII、FIX、FX活性均为标准品1＞标准品2＞标准品3。凝血因子FVII活性为标准品3＞标准品1＞标准品2。

图4 盐离子浓度对4种凝血因子活性测定的影响*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与标准品 1相比Fig.4 The influence on the activities of four coagulation factors inthree samples by standard human plasma*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 ，compared with No.1 of standard human plasma

2.5 不同公司试剂盒对PCC4种因子活性影响 按照《中国药典》（2010版）有关人凝血因子活性测定对PCC制品中FII、FVII、FIX、FX进行测定，结果测定如下表。通过t检验分析均有P＜0.05，差异显著。

表1 2厂家试剂盒测定4种凝血因子活性对比Tab.1 Comparison of the activities of four coagulation factors tested by regent kits of two companies

3 讨论

硫酸鱼精蛋白是一种碱性蛋白的硫酸盐，在体内可以中和肝素，致使肝素失去抗凝活性。理论上分析硫酸鱼精蛋白中和肝素后，测出的凝固时间会缩短，因子活性应该偏高，但是实验中测出的因子活性反而降低了。原因可能是硫酸鱼精蛋白过量所致，硫酸鱼精蛋白是一种弱抗凝剂，过量会使因子活性降低。因此在检测过程中，为使因子含量能够准确测定，应先测定PCC中肝素含量。

在实际检测过程中，由于乏浆相对昂贵，操作者往往在测定外源因子时，并没有严格按照药典操作，而是采用纯水或者配套稀释剂稀释。实验结果显示，不同的稀释处理会影响PCC中因子活性检测的准确性，且差异显著。对于FIX的活性测定，结果说明生理盐水与纯水无显著性差异，与配套稀释液差异显著。值得注意的是，2005版中国药典[13]规定用FIX乏浆进行稀释处理，而2010版却规定用生理盐水进行稀释处理，这一改变的原因有待进一步讨论研究。

在PCC生产工艺中，洗脱条件大多采用柠檬酸钠、NaCl溶液体系，虽然会对洗脱液进行脱盐处理，但是在PCC中还是会残留一定浓度的NaCl，且浓度水平存在较大差异，因此检测NaCl浓度对PCC中凝血因子活性的影响具有重要意义[14-16]。通过上述结果可得，较高浓度盐溶液会使PCC中凝血四种因子活性降低，但是在检测的过程中发现3种盐浓度下的PCC制品，FII和FIX在0.25 mol/L盐离子浓度下因子活性反而低于前2种情况下的活性，但是差异不显著。

在检验标准品对凝血因子活性检测的影响发现，不同的标准品对4种凝血因子的活性检测具有显著性影响，标准品1作为标准品测出的4种因子活性均值均比标准品2和标准品3高。在标定PCC中因子含量时应选择同一标准品，才能准确衡量凝血因子活性。采用2家公司的试剂检测同一种PCC制品，SIEMENS公司试剂测出的因子活性除FVII外，其他因子活性均高于国内某厂家试剂盒，且用配对t检验分析差异显著。

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Study on the in fl uening factors of four coagulation factors' altivity detemination in human prothrombin complex concentrates

TIAN Qian1，CAO Hai-jun2，CAO Ya1，HE Ze-chao1，LI Chang-qing2Δ
(1.College of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065， China;2.Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Science, Chengdu 610052，China)

ObjectiveTo study the influencing factors on detection of four coagulation factors' activity in prothrombin complex concentrates(PCC).MethodsUsing Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2010) as reference, the activity of four coagulation factors in PCC were investigated by choosing different pre-treatments, different diluents, different salt concentration, different standard human plasma and different company reagents.ResultsThe activity of FII, FVII, FX were decreased and FIX was increased in the condition of adding protamine sulfate, and there were no differences of four coagulation factors whether warm bath in 37 for 15 min or not. However, the differences of four coagulation factors were significant by using deficient plasma, saline, distilled water and commercial dilution buffer(P＜0.05). The activity of coagulation factor II, X in 1 mol/L salt concentration of PCC were significantly lower than in 0.25 mol/L(P＜0.05), while coagulation factor VII, IX were not. The activity of FII,FVII, FIX, and FX were different by using different standard human plasma to make standard curve. The activity of four coagulation factors existed significant difference(P=0.00) by using SIEMENS company reagents and domestic reagents.ConclusionChoosing different pre-treatments, different dilution buffers, salt concentration, standard human plasma and commercial kits will influence the detection result of coagulation factors.

prothrombin complex concentrates;protamine sulfate;dilution buffer;salt concentration;standard human plasma

R 446．11+

A

1005-1678(2014)02-0017-03

人凝血酶原复合物（prothrombin complex concentrates，PCC）是一种能促进血液凝固的静脉注射血浆蛋白制剂，富含依赖维生素K 合成的凝血因子（coagulation factor，F）II、VII、IX、X[1-2]。上世纪60年代用于临床，主要用于乙型血友病、维生素K依赖的凝血因子缺乏症等病症的治疗[3-4]。近年来用于口服香豆素类抗凝剂过量快速逆转的研究成为该领域热点[5-8]。2011以年，我国PCC短缺严重，目前多家厂家开展PCC的制备工艺及临床研究，其生产制备引起广泛关注[9]。因此，对于PCC中主要成分FII、FVII、FIX、FX的准确测定对PCC质量控制及临床疗效研究具有重要意义。

国内外药典都对PCC凝血因子活性测定进行了规定[10]，虽然《中国药典》（2010版）[11]也收录了4种凝血因子活性测定方法，但是其描述的检测步骤较为笼统，很多实验细节究竟对测定结果有何影响，未见国内外研究报道。此外，目前市场上凝血因子检测试剂较多，在PCC制备过程中样品含有较高的盐离子等，这些因素对测定结果有何影响，目前也没有较深入的研究。沈琦等[12]曾探究过PCC活性测定中的几种影响因素，但受限于当时的条件，仅采用血浆当量法（即PE法）对PCC中凝血因子总活性进行了粗探，此检测方法已不能满足目前对PCC质量控制的需要。本文在《中国药典》（2010 版）FII、FVII、FIX、FX 测定方法的基础上，采用不同样品前处理方式、不同稀释剂、不同盐离子浓度制品、不同测定标准品及不同厂家试剂，对此5种因素对PCC中4种因子活性测定的影响进行了较深入的探讨，旨在为PCC中主要作用的4种凝血因子活性测定提供参考和指导。

国家高技术研究发展计划（“863”计划）项目（2012 AA 021903-3）

田倩，女，硕士，研究方向：生物工程，E-mail：tian_qian 1989@126.com；李长清，通信作者，男，硕士，教授，研究方向：血液生化与分子生物学，E-mail：lichangqing 268@163.com。