紫杉醇联合金雀异黄素用于肺癌细胞的抑制效果评估

孙平，侯东彬

（华中农业大学医院，湖北 武汉 430070）

紫杉醇联合金雀异黄素用于肺癌细胞的抑制效果评估

孙平，侯东彬Δ

（华中农业大学医院，湖北 武汉 430070）

目的探讨紫杉醇（paclitaxel，PTX）联合金雀异黄素对肺癌细胞的抑制作用。方法将肺癌A549细胞随机分为生理盐水组、紫杉醇干预组、金雀异黄素干预组和联合干预组。MTT法研究紫杉醇联合金雀异黄素对肺癌A 549细胞的增殖抑制情况。流式细胞术检测给药后肿瘤细胞凋亡情况。建立A 549肺癌裸鼠移植瘤模型，计算抑瘤率。结果肺癌A 549细胞给药48 h后，紫杉醇干预组、金雀异黄素干预组和联合干预组对肿瘤细胞的抑制率分别为（57．0±4．5）%、（34．0±4．6）%和（77．0±4．4）%，差异具有统计学意义（P＜0．01）；紫杉醇干预组、金雀异黄素干预组和联合干预组凋亡率分别为63．4%、41．2%和84．5%，而生理盐水组凋亡率为7．6%，差异具有统计学意义（P＜0．01）；荷瘤小鼠实验结果显示，相比于生理盐水组，金雀异黄素组、紫杉醇组和联合干预组对肿瘤生长的抑制率分别为（18．2±3．4）%、（32．1±4．2）%和（63．4±5．1）%，联合干预组与其他单独给药组间差异具有统计学意义（P＜0．01）。结论紫杉醇与金雀异黄素均具有抑制肺癌细胞增殖的作用，2者联用能够发挥协同作用，增强抗肿瘤能力。

紫杉醇；金雀异黄素；肺癌细胞；联合

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清购自浙江四季青生物科技有限公司；金雀异黄素购自美国sigma公司，批号：G 131208；DMEM培养基购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；MTT试剂盒购自sigma公司；紫杉醇购自江苏恒瑞医药股份有限公司，（批号：S121105）；其余试剂为分析纯。A549人源性肺癌细胞购自上海细胞研究所；雄性裸鼠（20～25 g）购自山东大学医学院实验动物中心，动物许可证号：SDDX 201308231。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将A549细胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为5%CO2，湿度为13.5%，温度为37℃。待细胞汇合度为0.8～0.9时，用2.5 mg/L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT实验考察不同药物干预对A549的增殖抑制作用 培养A549细胞接种于96孔板中，随机分为生理盐水组、紫杉醇干预组、金雀异黄素干预组和联合干预组。当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时，分别加入无菌过滤后的紫杉醇（3 μg/mL）、金雀异黄素（3 μg/mL）、紫杉醇+金雀异黄素(紫杉醇，3 μg/mL＋金雀异黄素，3 μg/mL)各 20 μL。将孔板移入37℃ CO2孵箱中培养24 h和48 h后取出，每孔加入20 μl 5 mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中继续孵育4h，将孔板中液体倒出，每孔加入200 μL DMSO，37℃避光振摇15 min，用酶标仪在490 nm处测定各孔的光密度值（OD）。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 培养A549细胞接种于96孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的紫杉醇（3 μg/mL）、金雀异黄素（3 μg/mL）、紫杉醇+金雀异黄素(紫杉醇，3 μg/mL +金雀异黄素，3 μg/mL)各20 μL。将孔板移入37℃CO2孵箱中培养24 h后将A549细胞给药孵育24 h，然后用冰PBS清洗细胞3次，FITC/PI双染，细胞避光放置15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡数量。

1.2.4 肺癌异位肿瘤模型的建立 A549细胞经胰酶消化，离心后将其悬浮于DMEM培养液中，计数调节浓度至5×107个/mL。取4～6周龄，体重20～25 g的雄性裸鼠，将准备好的A549细胞悬浊液皮下接种于裸鼠背部，每只裸鼠接种0.1 mL细胞悬浊液。接种后1～2周可见背部长出肿瘤块，证明接种成功。将优选后的24只荷瘤裸鼠随机分成4组：生理盐水组、紫杉醇干预组（20 mg/kg）、金雀异黄素干预组（20 mg/kg）和紫杉醇（10mg/kg）+金雀异黄素（10 mg/kg）组。各组均采用腹腔注射给药，第21天处死小鼠，剖肿瘤，称重。取肿瘤切片，按照试剂盒提供的说明书进行TUNEL染色检测。

2 结果

2.1 对A549肿瘤细胞增殖的影响 MTT实验结果显示，紫杉醇和金雀异黄素均能抑制A549肺癌细胞的增殖。当紫杉醇和金雀异黄素联合用药时对肿瘤细胞的抑制能力大于单独用药。给药48 h后，紫杉醇干预组、金雀异黄素干预组和联合干预组对肿瘤细胞的抑制率分别为（57.0±4.5）%、（34.0±4.6）%和（77.0±4.4）%，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与生理盐水组相比，单独给药组和联合给药组均能有效抑制肿瘤细胞增殖，差异具有统计学意义（P＜0.01，见表 1）。

表1 不同干预方法对肺癌细胞的增殖抑制率（%）Tab.1 The inhibition rate of A549 cell by different treatments at 24 h and 48(%)

2.2 对A549肿瘤细胞凋亡的影响 体外研究药物诱导A549细胞凋亡的定量实验结果显示，紫杉醇、金雀异黄素和联合给药都能不同程度诱导肿瘤细胞的凋亡。紫杉醇、金雀异黄素和联合给药诱导肿瘤细胞凋亡率分别为63.4%、41.2%和84.5%，而生理盐水组凋亡率为7.6%。与生理盐水组相比，单独给药组和联合给药组均能有效诱导肿瘤细胞凋亡，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与紫杉醇和金雀异黄素单独给药相比，联合给药能够增强药物诱导肿瘤细胞凋亡作用，差异具有统计学意义（P＜0.01，见图1）。

图1 不同药物干预诱导肺癌细胞凋亡

2.3 对皮下移植肿瘤的影响 对荷瘤小鼠的治疗实验结果表明，生理盐水组肿瘤体积生长速度快，金雀异黄素组、紫杉醇组和联合干预组肿瘤生长依次减慢。相比于生理盐水组，金雀异黄素组、紫杉醇组和联合干预组对肿瘤生长的抑制率分别为（18.2±3.4）%、（32.1±4.2）%和（63.4±5.1）%，联合干预组与其他单独给药组间差异具有统计学意义（P＜0.01，见表1）。各组裸鼠肿瘤组织切片后TUNEL染色，棕色代表凋亡的肿瘤细胞，图2可见，联合干预组诱导凋亡的肿瘤细胞最多，其次是紫杉醇干预组和金雀异黄素干预组。

表2 不同干预方法对肺癌移植瘤的抑制率Tab.2 The inhibition rate of tumor in A549 bearing nude mice by different treatments

图2 肿瘤组织切片TUNEL染色（×200）Fig.2 HE stained tumor tissues(×200)

3 讨论

肺癌是全球最普遍发生的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居全球恶性肿瘤之首[10]。当前肺癌治疗效果不理想，其主要原因是早期诊断率不高，大多数患者被确诊为肺癌时已是中晚期或出现了远端转移。因此研究新的肺癌治疗方法显得十分重要。紫杉醇是临床常用的细胞毒类抗肿瘤药物。金雀异黄素是已经被报道对多种肿瘤细胞具有抑制作用，金雀异黄素是一种低毒、高效的抗癌成分，对肿瘤细胞具有多靶点的抑制作用[11-13]。目前国内外尚未见到金雀异黄素与化疗药物联合作用于肺癌的报道。

本研究将临床上已经证实的抗肿瘤药物紫杉醇与金雀异黄素联合使用，结果显示：紫杉醇与金雀异黄素联合使用能够显著抑制肺癌A549细胞的增殖。很多药物通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖，结果显示联合用药对于诱导肿瘤细胞凋亡的能力显著强于紫杉醇或者金雀异黄素单独给药，说明紫杉醇和金雀异黄素联合给药能够对肿瘤细胞凋亡起到协同作用。此外，还通过体内肿瘤异位模型考察了联合给药对肿瘤生长的抑制能力，结果与体外研究结果相一致。综上所述，紫杉醇和金雀异黄素联合使用能够有效抑制肺癌的发展，是一种潜在的肺癌治疗手段。对于金雀异黄素抑制肿瘤的机制可能与其阻断肿瘤细胞β-catenin信号途径，下调β-catenin核表达，上调其胞膜表达有关[14-15]。金雀异黄素抑制肿瘤的机制目前还在进一步的研究中。

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Evaluating the effect of paclitaxel and genistein on lung cancer A549 cell

SUN Ping，HOU Dong-binΔ

(Hospital of Central China Agricultural University,Wuhan 430070,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of paclitaxel and genistein on the treatment of lung cancer.MethodsA549 cells were divided into saline group, PTX group, Gen group and (PTX+Gen) group. The anti-proliferation efficiency of paclitaxel combined with genistein was evaluated by MTT assay and flow cytometry test. A 549 cells were injected into mice by hypodermic in order to establish the animal model, which were used to evaluate the effect of anti-tumor.ResultsThe cell viability of A 549 cells were(57.0±4.5)%,(34.0±4.6)% and (77.0±4.4)% after the treatment of paclitaxel, genistein and paclitaxel+ genistein, respectively(P＜0.01). The effect of saline induced cells apoptotic was 7.6%,while paclitaxel,genistein and paclitaxel + genistein were 63.4%、41.2% and 84.5%, respectively(P＜0.01).The tumor inhibitory rates were(18.2±3.4)%, (32.1±4.2)%and(63.4±5.1)% in vivo for genistein, paclitaxel and paclitaxel+ genistein(P＜0.01).ConclusionBoth paclitaxel and genistein can inhibit the growth of lung cancer cell lines, and the combination of paclitaxel and genistein may be a potentially effective treatment for lung cancer.

paclitaxel; genistein; lung cancer; combination

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0001-03

肺癌作为严重威胁人类健康的头号恶性肿瘤，国内每年新发肺癌患者约50万，到2025年预计我国每年将新发100万肺癌患者[1]。肺癌的治疗以手术为主，联合化疗为辅。摆在临床医师特别是肿瘤治疗医师面前的任务是极其繁重和艰巨的。当前肺癌治疗效果不理想，其主要原因是早期诊断率不高，大多数患者被确诊为肺癌时已是中晚期或出现了远端转移。紫杉醇是来源于红豆杉属太平紫杉的一种细胞毒性物质，被广泛用于乳腺癌[2]、卵巢癌[3]、肝癌[4]和非小细胞肺癌的治疗[5]。然而，以细胞毒为主的化学治疗缺乏选择性，难免产生许多不良反应和毒性，病人耐受性较差。肺癌的治疗迫切需要新的手段。紫杉醇能够通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用。紫杉醇可与游离的微管蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定的微管，同时抑制其解聚，导致丧失了正常功能的微管束的产生和微管的固定，从而抑制细胞的有丝分裂[6]。金雀异黄素是异黄酮类化合物的主要成分之一，广泛分布在大豆、黄芪、葛根等植物中，具有多种生理及药理活性。研究表明，金雀异黄素可抑制多种肿瘤细胞的生长且具有抗癌增敏作用[7-9]，被认为是一种很有潜力的肿瘤抑制剂。金雀异黄素能在体内外抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，还可阻断肿瘤细胞β-catenin信号途径，下调β-catenin核表达，上调其胞膜表达。本研究拟探讨金雀异黄素联合紫杉醇对肺癌A549细胞增殖的影响以及对荷瘤小鼠肿瘤的治疗效果，为临床治疗提供更多的实验依据。

国家自然科学基金（81171365）

孙平，男，本科，主治医师，研究方向：肺癌的基础与临床治疗研究，E-mail：2094252562@qq.com；侯东彬，通信作者，女，本科，副主任医师，研究方向：肺癌的基础与临床治疗研究，E-mail:315652027@qq.com。