紫杉醇-壳聚糖缓释膜对胆管成纤维细胞增殖的抑制作用

宋飞 ，向盈盈 ，张小文Δ

（1.昆明医科大学 第二附属医院 肝胆胰外二科，云南 昆明 650101；2.昆明市延安医院 口腔科，云南 昆明 650031）

紫杉醇-壳聚糖缓释膜对胆管成纤维细胞增殖的抑制作用

宋飞1，向盈盈2，张小文1Δ

（1.昆明医科大学 第二附属医院 肝胆胰外二科，云南 昆明 650101；2.昆明市延安医院 口腔科，云南 昆明 650031）

目的探讨紫杉醇-壳聚糖缓释膜（PTX-Chitosan Sustain film，PTX-CSF）对胆管成纤维细胞增殖和凋亡的影响。方法采用组织块法进行成纤维细胞的原代单细胞培养。将实验分为5组：未处理组，单纯PTX处理组（250 nM）和低、中、高壳聚糖PTX缓释膜处理组（100 nM、250 nM、500 nM）。使用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法检测细胞的增殖情况，划痕实验检测紫杉醇对TGF-β1诱导细胞迁移的抑制作用，流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞的凋亡及细胞周期。结果紫杉醇-壳聚糖缓释膜能有效抑制胆管成纤维细胞的增殖，具有剂量和时间依赖性。其抑制作明显强于单纯的紫杉醇用药，且随着时间的延长，优势逐渐体现。紫杉醇-壳聚糖缓释膜能有效抑制TGF-β1对胆管成纤维细胞的促迁移作用，较单纯PTX组具有更长的时间效应。72 h时，紫杉醇-壳聚糖缓释膜组成纤维细胞的凋亡率显著高于单纯PTX组和对照组（P＜0．05），后2者之间无统计学差异。72 h时，紫杉醇-缓释膜组和单纯PTX组的G 2/M期细胞比例均较未处理组显著增加，2者相比，前者也明显高于后者，差异均具有统计学意义（P＜0．05）。结论紫杉醇-壳聚糖缓释膜具有较强的细胞毒性作用及明显的缓释效果，可以维持较长时间的有效浓度，从而较单纯紫杉醇用药更能持续地抑制胆管成纤维的增殖。

紫杉醇-壳聚糖缓释膜；胆管成纤维细胞；增殖；细胞凋亡

1 材料与方法

1.1 材料 PRIM 1640培养基（hyclone公司，货号：11875-093），胎牛血清（Gibco公司，货号：10099141），胰酶-EDTA消化液（Gibco公司，货号：25200-056），二甲基亚砜（sigma公司，货号：D-2650），PTX(重庆美联制药有限公司，货号：G 0411003)，细胞凋亡及周期检测试剂盒（南京凯基生物，货号：KGA 107)。紫杉醇-N-琥珀酰化羟乙基壳聚糖缓释膜为本实验室前期制成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用组织块法进行成纤维细胞的原代单细胞培养。将手术切除的组织样本收入无菌的PRIM 1640培养基中，在超净台上清除其他组织，将组织块剪碎为1 mm3的小块，接种于培养瓶的底部，加入3 mL 0.25%胰酶-EDTA消化液，放入37℃水浴中消化25 min，消化完毕后加入等量含10%FBS的PRIM 1640培养基内终止消化。滤去组织块后，吸取滤液入离心管800 r/min离心5 min，弃上清。再用培养基重悬细胞悬液，移至培养瓶，均匀铺满瓶底后置于37℃，5%CO2培养箱内培养。3 d后出现梭状成纤维细胞，待细胞爬满瓶底后，用0.25%的胰酶EDTA消化液进行消化传代。取3～4代细胞使用。

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖抑制率 实验分为5组：未处理组、单纯PTX处理组（250 nM）和低、中、高壳聚糖PTX缓释膜处理组（100 nM、250 nM、500 nM）。取对数生长期5×103个/mL的细胞接种于96孔培养板内，培养24 h后，按照实验分组，加入相应浓度的药物进行干预。每组设6个复孔，每板设空白对照。培养1～5 d，每隔24 h取板进行MTT比色法检测。测定每孔492 nm处的吸光度值，计算成纤维细胞的增殖抑制率[（对照组-实验组）/对照组×100%]。实验重复3次。

1.2.3 划痕法观察细胞迁移 实验分为4组，未处理组，TGF-β1处理组（5 nM），单纯PX处理组（250 nM）和PTX壳聚糖缓释膜处理组（250 nM）。取对数生长期2×105个/mL的细胞接种于6孔培养板内培养，待细胞融合度＞90%时，垂直于孔背面的横线划痕标记，按实验分组分别于各组对应的孔内加入1mL含相应浓度药物的10%FBS PRIM 1640培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养，分别于 0 h、24 h、48 h、72 h 随机选取视野进行拍照观察。

1.2.4 流式细胞仪检测 实验分为4组，未处理组，TGF-β1处理组，单纯PX处理组（250 nM）和PTX壳聚糖缓释膜处理组（250 nM）。取对数生长期2×105个/mL的成纤维细胞接种于6孔板中，培养24 h后，按实验分组分别加入相应浓度的药物进行干预。培养箱中继续培养1～3 d，每隔24 h收集1次细胞，用无菌PBS离心洗涤3次，调整细胞悬液浓度为1×106个/mL，取195 uL细胞悬液，加入5uL Annexin V-FITC混合，室温下反应10 min，1000 r/min离心5 min，弃去上清液，细胞沉淀用PBS洗1次，再离心，细胞沉淀重悬于190 uL稀释缓冲液中，加入浓度为20 ug/mL的碘化丙丁10 uL，反应10 min后，采用流式细胞仪对样品进行检测。实验重复3次、

1.3 统计学方法 数据处理采用SPSS 16.0进行分析，正态计量资料以“±s”表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTX壳聚糖缓释膜对成纤维细胞增殖的影响 MTT实验结果显示各浓度的PTX壳聚糖缓释组与单独PTX处理组对胆管成纤维细胞均具有明显的抑制作用。PTX壳聚糖缓释膜对成纤维细胞的增殖抑制具有剂量和时间依赖性。在用药后24 h，单纯PTX处理组的细胞增殖抑制率大于同时间不同载药浓度的PTX壳聚糖缓释膜，差异具有统计学意义（P＜0.05）。48 h时，PTX壳聚糖缓释膜组的抑制率继续增加，而单纯PTX组的抑制率明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。到72 h时，单纯PTX组中药物对细胞几乎无抑制效果，而PTX壳聚糖缓释膜的抑制仍存在，差异具有统计学意义（P＜0.05，见图1）。

图1 PTX壳聚糖缓释膜对成纤维细胞增殖的影响

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2.2 胆管成纤维细胞的迁移情况 划痕实验结果表明，PTX壳聚糖缓释膜组和单纯PTX组均能有效抑制TGF-β1诱导的胆管成纤维细胞的迁移。正常对照组划痕宽度在24、48、72 h后随着细胞的增殖划痕宽度逐渐变小，TGF-β1处理组较正常组宽度变小的幅度更加快速；而单纯PTX组有效抑制了TGF-β1引起的这种快速变化，48 h时达到最佳，72 h后宽度又显著减小；而PTX壳聚糖缓释膜组在24、48、72 h均能有效抑制胆管成纤维的迁移情况，72 h仍能维持其抑制效果，划痕宽度明显大于单纯PTX组，差异具有统计学意义（P＜0.05，见图2）。

图2 PTX壳聚糖缓释膜和PTX对胆管成纤维细胞迁移增殖的影响Fig.2 Effect of PTX-CSF and PTX on the proliferation of bile duct fibroblast

2.3 PTX壳聚糖缓释膜和PTX对胆管成纤维细胞凋亡的影响 利用流式细胞仪对PT壳聚糖缓释膜和单纯PT诱导的胆管成纤维细胞凋亡率进行检测（见图3）。其中左上象限为机械性损伤细胞，右上象限为晚期凋亡或坏死细胞，左下象限为阴性正常细胞，右下象限为早期凋亡细胞。流式细胞结果显示：单纯PTX在250 nM浓度下其凋亡率和正常细胞以及TGF-β1组细胞无显著性差异，而PTX壳聚糖缓释膜组的凋亡率较单纯PTX组显著增加（P＜0.05）。在72 h时凋亡率显著高于同时间的单纯PTX组（见图3）。

图3 PTX壳聚糖缓释膜和PTX对胆管成纤维细胞凋亡的影响（72 h）Fig.3 Effect of PTX-CSF and PTX on the apoptosis of bile duct fibroblast (72 h)

2.4 PTX壳聚糖缓释膜和PTX对胆管成纤维细胞周期的影响 利用流式细胞仪对4组处理的细胞进行细胞周期的检测，结果发现相对于未处理的胆管成纤维细胞，单纯PTX和PTX壳聚糖缓释膜均能有效地引起G2-M期胆管成纤维细胞的增加，降低G0-G1期细胞的减少，差异具有统计学意义（P＜0.05，见图4）。2者进行比较，PTX缓释膜组较单纯PTX组的G2-M期细胞显著增加，G0-G1期细胞减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 PTX缓释膜和单纯PTX对胆管成纤维细胞周期的影响（72 h）Fig.4 Effect of PTX-CSF and PTX on the cell cycle of bile duct fibroblast (72 h)

3 讨论

胆道手术后的损伤是当今胆道外科所面临的一个难题，其发生发展存在多种因素，其中胆管成纤维细胞的过度活跃是胆管瘢痕或狭窄的主要因素[12]。胆管瘢痕的形成机制目前还尚不明确，但是TGF-β被公认为是可以促进瘢痕形成的重要细胞因子，它主要的作用机制是促进胆管成纤维细胞细胞的异常增殖，抑制其凋亡；促进瘢痕组织中胶原的大量合成；抑制胶原酶合成并增加其组织抑制剂的表达；促进胆管成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并分泌α-SMA，从而导致瘢痕挛缩；激活下游细胞的信号通路因子等[13-15]。

紫杉醇作为一种天然的抗癌药物已在临床广泛应用，由于瘢痕组织和肿瘤细胞过度增殖的共同特征，在抑制胆管瘢痕方面也发挥了重要作用[16]。Choi的研究表明，紫杉醇可以干扰TGF-β1信号通路，从而阻断胆管上皮细胞和肌成纤维细胞之间的联系[17]；Hirose等研究表明低剂量的紫杉醇可以有效抑制TGF-β1引起的胆管癌细胞的增殖。其机制是紫杉醇可以有效阻滞细胞于G2或M期，从而促进细胞死亡[5]。尽管紫杉醇具有良好的抑制瘢痕活性，但是紫杉醇本身的低水溶性给其静脉给药带来很大困难。而在注射剂中采用表面活性剂虽然能增加紫杉醇的水溶性，但也会引起多种副作用导致在对患者用药本身常常带来痛苦，因此，如何将紫杉醇安全有效迅速地输送至损伤处成为研究热点。目前，已经有多种基于纳米颗粒所包装的紫杉醇输药系统[6]，但关于其缓释膜系统尚未见报道。

本文研制了一种新型的紫杉醇壳聚糖缓释膜，并从对胆管成纤维细胞的增殖及凋亡两方面与单纯紫杉醇用药进行了比较。结果表明紫杉醇壳聚糖缓释膜和单纯PTX均可以有效抑制TGF-β1诱导的胆管成纤维细胞的增殖，其48 h时作用最为明显，但72 h时单纯PTX抑制效果明显降低，而紫杉醇壳聚糖缓释膜仍具有明显抑制效果，数据显示2者差异有统计学意义。我们进而对所引起的细胞凋亡进行了深入研究，发现在250 nM的用药浓度下，单纯紫杉醇并没有引起胆管成纤维细胞的显著凋亡，而紫杉醇壳聚糖缓释膜反而促进了TGF-β所诱导的成纤维细胞凋亡，进一步检测细胞周期发现，无论是单纯PTX还是PTX壳聚糖缓释膜均能引起G 2-M期细胞增多，这说明细胞存在DNA复制和有丝分裂障碍，这与紫杉醇的作用机制相一致[18]。G 0-G1期细胞减少，而G 2-M期细胞增多，提示了PTX可有效抑制S期DNA合成，使成纤维细胞滞留于G 2-M期。但有趣的是，这一过程中单纯PTX并未引起细胞的显著凋亡，而缓释膜反而促进了成纤维细胞的凋亡。对于这一现象，我们推测可能是因为紫杉醇对凋亡的效果需要长时间的累积，但目前的研究尚无这方面的报道，这值得我们进行深入研究。

本研究结果表明，我们研制的紫杉醇壳聚糖缓释膜能较单纯PTX更有效地阻滞胆管成纤维细胞周期，干扰DNA复制和有丝分裂，进而促进细胞凋亡抑制成纤维细胞的增殖，且随着时间效果越发明显。本研究为临床上胆管瘢痕或狭窄用药治疗提供了一个新的参考。

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Inhibitation of paclitaxel-chitosan sustain fi lm on biliary fi broblasts cell proliferation

SONG Fei1,XIANG Ying-ying2,ZHANG Xiao-wen1Δ

(1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101,China;2.Department of Stomatology, The Affiliated Yan’an Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650051,China)

ObjectiveTo explore the effect of Paclitaxel-Chitosan Sustain film on growth, apoptosis and cell cycle of biliary fibroblasts cell.MethodsHuman biliary fibroblasts cell were cultured and treated with PTX-CSF and naked PTX,separately, untreated cells as blank control. The experiment was divided into five groups: untreated group, simple PTX-treated group (250nM) and low, medium and high chitosan sustained-release film PTX-treated group (100 nM, 250 nM, 500 nM). The proliferations of cells were determined by MTT assay. The apoptosis and cell cycle of cells were detected by FCM.ResultsThe proliferation of biliary fibroblasts cells was inhibited by PTX-CSF with time-dependent and dose-dependent,and the inhibiting effect was more obvious than naked PTX treatment as the time went on. Meanwhile, PTX-CSF could inhibit the magration of bile duct fibroblasts induced by TGF-β 1,and had longer effect than naked PTX. After 72 h, the apoptosis rate of cell treated with PTX-CSF was significantly higher than that treated with naked PTX or untreated cell(P＜0.05), the difference between naked PTX or untreated cells was not significant. Compared with untreated cells, the proportion of G 2/M in cells treated with PTX or PTX-CSF were significantly increased, and the former was sinificantly higher than the latter(P＜0.05).ConclusionCompared with naked PTX, PTX-CSF has strong cytotoxic effects and obviously sustained-release effect. The effective concentration can be maintain for a long time by PTX-CSF, and it could be as the novel drug delivery system to continuously inhibit proliferation of bile duct fibroblasts.

paclitaxel;chitosan sustain film;biliary fibroblasts cells;proliferation;apoptosis

R-33；R 285．5

A

1005-1678(2014)02-0004-04

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是从红豆杉（Taxusbrevifolia）树皮中萃取而来的一种熔点为210℃的白色结晶粉末[1]。目前广泛应用于临床治疗各种癌症，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌等等[2]。有研究表明紫杉醇能有效抑制胆管损伤后胆管瘢痕的形成，其作用机制是PTX可以促进和稳定微管，抑制细胞停滞在G2或M期，无法进行正常的有丝分裂从而促使细胞死亡[3-6]。

PTX使用的主要缺陷在于其水溶性极低（＜0.004 mg/mL），因此目前临床上使用的是商品化PX注射剂——Taxol。PTX被配制在聚氧乙烯化蓖麻油的有机溶剂（聚氧乙烯蓖麻油）和脱水乙醇（50/50，V/V）中。其中的助溶剂聚氧乙烯蓖麻油不良反应较大（如血液毒性、神经毒性、过敏反应等）[7-9]。因此，越来越多的研究致力于改善PTX的水溶性，以使其安全有效迅速运输至患者体内[10]。壳聚糖输药系统发展至今较为成熟，在本研究中，我们采用Dhanikula等[11]的方案研制出不同浓度的PTX-壳聚糖缓释膜，对比检测其与单纯PTX对胆管成纤维细胞增殖的影响，随后在转化生长因子β 1（transforming growth factor-β，TGF-β）的诱导下，观测PTX缓释膜对胆管成纤维细胞迁移和凋亡的影响，对比研究缓释膜与单纯用药的差异，为胆管瘢痕临床用药新剂型提供理论基础。

国家自然科学基金地区科学基金项目（81260084）

宋飞，男，博士，主治医师，研究方向：肝胆胰外科，E-mail：85291753@qq.com；张小文，通信作者，男，博士，主任医师，教授，研究方向：肝胆胰外科，E-mail：283073084@qq.com。