骨碎补总黄酮对去卵巢骨质疏松大鼠骨内谷氨酸信号Glu、mGluR5以及EAAT1的影响

方霁，杨丽 ，沈家珍，梁恒，张荣华

（1.暨南大学 医学院，广东 广州 510632；2.暨南大学 药学院，广东 广州 510632）

骨碎补总黄酮对去卵巢骨质疏松大鼠骨内谷氨酸信号Glu、mGluR5以及EAAT1的影响

方霁1†，杨丽2†，沈家珍1，梁恒1，张荣华2Δ

（1.暨南大学 医学院，广东 广州 510632；2.暨南大学 药学院，广东 广州 510632）

目的探讨骨碎补总黄酮（Total Flavonoids of Rhizoma Drynariae，TFRD）对去卵巢骨质疏松（osteoporosis，OP）大鼠骨内谷氨酸信号的影响，以明确其通过参与大鼠骨内谷氨酸信号通路介导骨重建的可能机制。方法45只3月龄SPF级雌性SD大鼠随机分为假手术组（Sham，n=15）和去卵巢组（OVX，n=30）。采取双侧卵巢切除术复制OP大鼠模型，14周后行双能X线测定骨密度，模型复制成功，将OVX组随机分为模白组（OVX，n=15）和给药组（OVX+TFRD，n=15）。药物干预12周后处死动物，免疫组化法观察左股骨骨骺端谷氨酸（Glutamate，Glu）、代谢型Glu受体-5（metabotropic glutamate receptor 5，mGluR 5）及L-谷氨酸/L-门冬氨酸转运体（Glutamate/Aspartate transporter，EAAT1）表达。结果Glu和mGluR5主要分布于骨髓区细胞和紧贴骨髓腔壁的成骨细胞（osteoblasts，OB）；Glu的阳性标记在Sham、OVX和OVX+TFRD组的表达差异均无统计学意义；OVX+TFRD组代谢型受体mGluR5的阳性表达显著高于Sham组（P=0．009），而Sham组与OVX组之间的差异无统计学意义；转运子EAAT1除了大量分布于骨髓区细胞以外，还有少量表达于骨陷窝中的骨细胞，其阳性表达在Sham、OVX和OVX+TFRD组的差异均无统计学意义。结论在骨内Glu信号通路中，TFRD可显著提高代谢型受体mGluR5的表达，但尚不能认为其对Glu和转运子EAAT1有影响。

骨质疏松症；去卵巢大鼠；骨碎补总黄酮；谷氨酸；代谢型Glu受体-5

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品制备 清洁级3月龄雌性SD大鼠45只，体质量（249.58±15.65）g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2008-0002。饲养于（22±20）℃，相对湿度40%的清洁环境。强骨胶囊购自广州宝芝林大药房，主要成分为TFRD，每1 g提取物相当于生药66.7 g，取0.25 g×12粒，将胶囊内容物取出，置于500 mL锥形瓶中，加入144 mL蒸馏水，配制成浓度为15 mg/mL的溶液，置于4℃冰箱保存。

1.2 主要仪器及试剂 Prodigy型双能X线骨密度仪（Lunar）、2-16 K 型台式高速冷冻离心机（Sigma）、BX 43型奥林巴斯显微镜（Olympus）、Finesse 325型轮转切片机（Shandon）、DAB显色试剂盒、即用型SABC免疫组化染色试剂盒以及抗体稀释液均购自武汉博士德生物工程有限公司；抗Glu多克隆抗体（兔抗）、抗mGluR5抗体（兔抗）以及EAAT1抗体（兔抗）为英国Abcam公司产品。

1.3 方法

1.3.1 动物模型与分组45只3月龄雌性SD大鼠随机分为Sham组（n=15）与OVX组（n=30），OVX组行双侧卵巢切除术，造模14周后行双能X线扫描测定骨密度（bone mineral density，BMD），确定OP模型复制成功后再将OVX组随机分成OVX组（n=15）和OVX+TFRD 组（n=15）。Sham组找到卵巢不切除。

1.3.2 给药方法造模14周后，测定各组BMD。确定造模成功后，将模型组随机分为OVX和OVX+TFRD组，将强骨胶囊配制成浓度为15 mg/mL的溶液，按临床成人剂量根据大鼠体重换算给药量为 45 mg/（kg·d）。Sham 组与 OVX 组按 10 mL/（kg·d）的蒸馏水灌胃。灌胃为1次/天，连续6天/周，停1 d。连续灌胃12周。

1.3.3 骨组织标本制备留取左侧股骨为观察指标：大鼠称重，2%戊巴比妥钠按0.1 mL/100 g腹腔内注射麻醉。取仰卧位，固定四肢及头部，沿侧胸壁打开胸腔，暴露心脏， 将灌注针从心尖部经左心室插入升主动脉，立即剪开右心耳，注入4%多聚甲醛300 mL进行内固定，直至流出清亮液体、大鼠四肢僵直为灌注完毕，取出左侧股骨，置于4%多聚甲醛液放置在4℃冰箱内固定15～20 h。

1.3.4 免疫组织化学染色①切片常规烤片，脱蜡，进行SABC染色。具体步骤如下：3%H2O2室温静置孵育10 min；0.1%胰蛋白酶37℃修复抗原15 min；5滴封闭液（加正常山羊血清）室温下静置20～30 min，甩去多余液体，不洗；滴加一抗（Glu 为 1∶300；mGluR5 为 1∶500；EAAT1为 1∶500）室温静置2 h，阴性对照以蒸馏水代替一抗，滴加Ⅱ抗20℃～37℃静置1 h；滴加SABC 20℃～37℃静置20 min；滴加DAB显色剂，显微镜下观察控制反应时间。以上步骤间均用0.01 M PBS（pH 7.2）缓冲液洗涤5 min×3次。苏木素复染，常规脱水，透明，封片。②结果分析：胞浆或者包膜为淡黄色、棕黄色或褐色为阳性标记。以德国Leica公司产的图像分析软件LeicaQwin-Plus在阳性区域进行分析，每张切片在100倍的视野下随机选取5个视野拍照，运用Image-pro plus 6.0图像分析软件对每张图片阳性表达区的平均光密度进行分析，阳性表达区的选取采用吸管法。

2 结果

2.1 去卵巢OP大鼠模型复制成功 大鼠去卵巢14周，OVX组与Sham组的BMD比较情况见表1。

表1 大鼠去卵巢14 wBMD的比较（g/cm2）Tab.1 Comparison of BMD 14 weeks after ovariectomy(g/cm2)

去卵巢14 w，采用双能X射线骨密度仪测定L5～L6、右股骨近端、右股骨远端、左股骨近端、左股骨远端、右肱骨近端、左肱骨近端等部位BMD，OVX组L5～L6腰椎、右股骨近端、右股骨远端、左股骨近端、左股骨远端、右肱骨近端 BMD均显著低于Sham组（P＜0.05），提示去卵巢OP大鼠模型复制成功。

2.2 TFRD对去卵巢OP大鼠左股骨Glu免疫标记的影响Glu的阳性表达可见于Sham、OVX及OVX+TFRD的骨髓区细胞和紧贴骨髓腔的OB（见图1）。其在各组阳性表达的平均光密度值，3组之间的差异无统计学意义（见表2）。

图1 大鼠股骨Glu的表达（×100）Fig.1 The expression of Glu in rat bone tissue(×100)

表2 大鼠骨组织Glu阳性表达的平均光密度（AU/单位面积）Tab.2 The average optical density of Glu expression in bone tissue (AU/unit area)

2.3 TFRD对去卵巢OP大鼠左股骨mGluR5免疫标记的影响 mGluR5的阳性表达见于Sham、OVX及OVX+TFRD的骨髓区细胞和紧贴骨髓腔壁的OB（见图2），其在各组阳性表达的平均光密度值见表3。统计结果显示OVX+TFRD组mGluR5阳性标记的平均光密度显著高于Sham组（P＜0.05）。

图2 大鼠股骨mGluR5的表达（×100）Fig.2 The expression of mGluR 5 in rat bone tissue(×100)

表3 大鼠骨组织mGluR5阳性表达的平均光密度（AU/单位面积）Tab.3 The average optical density of mGluR5 expression in bone tissue (AU/unit area)

2.4 TFRD对去卵巢OP大鼠左股骨EAAT1免疫标记的影响 EAAT1大量表达于Sham、OVX及OVX+TFRD组的骨髓区细胞和紧贴骨髓腔的OB，少量表达于骨陷窝中的骨细胞（见图3）。其在各组阳性表达的平均光密度值见表4，3组之间的差异无统计学意义。

图3 大鼠股骨EAAT1的表达（×100）Fig.3 The expression of EAAT1 of rat bone tissue(×100)

表4 大鼠骨组织EAAT1阳性表达的平均光密度（AU/单位面积）Tab.4 The average optical density of EAAT1expression in bone tissue (AU/unit area)

3 讨论

Glu信号控制OB的骨形成和调节成骨祖细胞的分化。激活的离子型受体促使成骨祖细胞增殖，并通过激活Cbfa-1刺激成骨祖细胞的分化，促进骨形成。离子型受体的激活也刺激核转录因子-kB（Nuclear Factor-kB，NF-kB）介导的破骨细胞（osteoclasts，OC）的分化和抑制成熟OC的凋亡，升高OC数量和骨吸收。然而骨量的最终变化则是由各信号通路作用于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的净效益决定。在Glu信号通路中，Glu离子型受体的激活主要与钙信号（包括胞外钙内流以及胞内钙库外流）有关，并由此触发各种钙-依赖酶的级联反应，导致各种细胞的生理变化[5-8]。而Glu代谢型受体的激活发挥第二信使作用，同时激活PKC信号通路，介导骨组织细胞的长程增强反应或者类似中枢记忆信号反应[9]，调节骨组织细胞的生理活性和分化成熟等细胞进程。本研究目的在于探究Glu信号受体的骨内分布特征及TFRD对其干预的影响。研究发现OP大鼠股骨内Glu表达于骨髓区细胞及OB，与文献报道一致[10]，但TFRD对其表达没有直接影响；Glu代谢型受体mGluR5在骨髓区细胞与紧贴着骨髓腔壁的OB上均有表达，与文献报道一致[11-12]，并且TFRD干预12周可显著提高去卵巢OP大鼠股骨mGluR5的表达，可能是其通过参与骨内谷氨酸信号转导介导骨重建的可能机制之一。Glu转运体是起到灭活多余的Glu，以达到终止其信号的功能。Takarada等人证明OB表达有多种Glu转运体（如EAAT1、EAAT2和EAAT3/EAAC1）并证明其具有吸收功能[1，13-14]。这些转运体的存在可以保证骨组织细胞Glu浓度保持在一定水平，并可以防止Glu信号的持续刺激占据受体从而影响信号交流[15-16]。本研究发现Glu转运子EAAT1表达于骨髓区细胞、OB及少量骨细胞，与Kalariti N等[17]发现EAAT1与mGluR5表达于MG-63成骨细胞样骨肉瘤细胞具有一定的相似性，但并没有发现TFRD的干预对其表达增高或降低有明显作用。

综上所述，在骨内Glu信号通路中，本研究通过免疫组化法观察到使用TFRD干预12周可显著提高去卵巢OP大鼠股骨mGluR5的表达，但尚不能认为有增加或降低Glu和EAAT1表达的作用。

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Effect of total fl avonoids of rhizome drynariae on the expression of Glu,mGluR5 and EAAT1 in bone tissues of ovariectomized osteoporotic rats

FANG Ji1†, YANG Li2†, SHEN Jia-zhen1, LIANG Heng1, ZHANG Rong-hua2Δ

(1.School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2.Pharmacy college, Jinan University，Guangzhou 510632, China)

ObjectiveTo observe the expression of Glu、mGluR 5 and EAAT 1 in bone tissues of ovariectomized osteoporotic rats and the effects of Total Flavonoids of Rhizoma Drynariae (TFRD) on it.Methods45 SPF 3-month-old Sprague-Dawley (SD) female rats were randomly divided into sham operation (Sham, n=15) group and ovariectomized (OVX, n=30) group. The osteoporotic(OP) model was established by bilateral ovariectomy, 14 weeks later, we measured bone mineral density(BMD) by dual-energy X-ray and determined that OP model was successfully replicated, OVX group rats were then divided into OVX group (n=15) and OVX+TFRD group (n=15). The OVX+TFRD group was given TFRD for 12 weeks. Glutamate (Glu), metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR 5), and Glutamate/Aspartate Transporter (GLAST/EAAT1)’s expression of femur was examined in order to clarify the characteristics of bone glutamate signaling pathway and the effects of TFRD on it.ResultsGlu and ionotropic receptors mGluR 5 mainly distributed in bone marrow cells and osteoblasts closed to the bone marrow cavity walls. There were no significant differences in Glu expression among Sham group, OVX group and OVX+TFRD group. The mGluR 5 expression of OVX+TFRD group was significantly higher than that of Sham group and OVX group(P=0.009), while no significant difference was found between the latter two groups.In addition to large distribution in bone marrow cells, small amount of transporter EAAT1was noted to express in bone cells of the bone lacunae.There were no significant differences in EAAT 1 expression among the three groups.ConclusionIn bone glutamate signaling pathway, this study demonstrated that TFRD could significantly improve the ionotropic receptor mGluR 5’s expression, but had no influence for Glu and EAAT1.

osteoporosis; ovariectomized rat; total flavonoids of rhizoma drynariae; glutamate; metabotropic glutamate receptor 5

R 932

A

1005-1678(2014)02-0010-04

骨组织中谷氨酸（Glutamate，Glu）信号通路的组成与中枢神经系统类似[1]，由Glu、相关转运体、转运囊泡、相关受体、受体激活后钙信号、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophos Phate，cAMP）信号的级联以及Glu代谢有关的酶如谷氨酰胺合成酶及Glu胺酶组成[2-4]。本研究通过免疫组化法观察去卵巢骨质疏松（osteoporosis，OP）大鼠骨组织Glu、代谢型Glu受体-5（metabotropic Glumatemate receptor 5，mGluR 5）及 L-谷氨酸/L-门冬氨酸转运体（Glutamate/Aspartate transporter，GLAST/EAAT1）表达特点，探讨骨碎补总黄酮（total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD）通过参与大鼠骨内谷氨酸信号通路介导骨重建可能的作用机制。

国家自然科学基金（81173619）

方霁，女，硕士，研究方向：中西医结合防治常见老年病，E-mail：fangji_luxixi 910@126.com；杨丽，共同第一作者，女，博士，研究方向：临床中药学，E-mail：doctormonkey@126.com；张荣华，通信作者，男,博士，教授，博士生导师，研究方向：临床中药学，E-mail：tzrh@jnu.edu.cn。