头孢曲松和亚胺培南对脓毒症大鼠肠道菌群及细菌耐药性的影响

边金洞，周祖模，张苏江

（1.诸暨市人民医院 感染内科，浙江 诸暨 311800；2.江苏省人民医院 感染科，江苏 南京 210029）

头孢曲松和亚胺培南对脓毒症大鼠肠道菌群及细菌耐药性的影响

边金洞1，周祖模1，张苏江2

（1.诸暨市人民医院 感染内科，浙江 诸暨 311800；2.江苏省人民医院 感染科，江苏 南京 210029）

目的探讨头孢曲松和亚胺培南对脓毒症大鼠肠道各种菌类数量以及细菌耐药性的影响。方法从48只健康SD大鼠中随机抽取8只为正常对照组，其余40只按照15mg／kg腹腔注射内毒素的方式建立内毒素脓毒症模型；根据建模后24 h是否应用抗生素以及抗生素应用时限再将40只内毒素脓毒症模型鼠细分为脓毒症未治疗组、脓毒症头孢曲松3 d组、脓毒症头孢曲松7 d组、脓毒症亚胺培南3 d组和脓毒症亚胺培南7 d组（n＝8）。在用头孢曲松和亚胺培南腹腔注射治疗期间，在给药第3 d和第7 d后分别取大肠内容物进行肠道杆菌、肠球菌和真菌的定量培养和细菌的菌种鉴定。结果用抗生素治疗后，2组大鼠肠道优势菌大肠杆菌和粪肠球菌数量均显著减少（P＜0.05），头孢曲松选择出铜绿假单胞菌和阴沟杆菌，亚胺培南选择出肺炎克雷伯杆菌、变形杆菌和屎肠球菌等条件致病菌，均表现出耐药倾向。结论头孢曲松和亚胺培南抗生素可引起原籍菌群数锐减，铜绿假单胞菌和屎肠球菌等条件致病菌成为优势菌群，引发肠道微生态环境紊乱。

头孢曲松；亚胺培南；大鼠；脓毒症；耐药性

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备与分组 健康雄性SD大鼠48只，体质量220～250 g，由上海西普尔－必凯实验动物中心提供［动物许可证号，SCXK（沪）2011—0028］。大鼠适应性喂养1周，禁食不禁水12 h。48只大鼠随机分为6组，每组8只，随机选取1组设为正常对照组，其余5组均按照15mg／kg腹腔注射内毒素建立脓毒症模型后再随机分为脓毒症未治疗组（不给予治疗）、脓毒症头孢曲松3 d组（即采用头孢曲松治疗3 d后）、脓毒症头孢曲松7 d组（即采用头孢曲松治疗7 d后）、脓毒症亚胺培南3 d组（即采用亚胺培南治疗3 d后）和脓毒症亚胺培南7 d组（即采用亚胺培南治疗7 d后）。在内毒素注射24 h后，脓毒症头孢曲松3 d组和7 d组给予头孢曲松（罗氏芬，上海罗氏制药有限公司，批号H10983036），脓毒症亚胺培南3 d组和7 d组给予亚胺培南（泰能，杭州默沙东制药有限公司，批号H20040508）治疗，剂量均为120mg／kg，2种抗生素的给药方式均分为2次间隔12 h腹腔注射。在相应时相点分别将各组大鼠活杀，并在无菌条件下采集标本。

1.2 指标检测 无菌条件下打开腹腔，切开大肠壁，取其内容物，约0.5 g，以生理盐水10倍稀释为原液，取原液进行1∶10、1∶100、1∶1 000倍比稀释，根据各菌群所需培养液成分的不同，分别取100μL原液梯度稀释液涂布于哥伦比亚血琼脂平板（主要用于分离培养肠道弯曲菌、幽门螺杆菌等）、麦康凯平板（主要用于分离培养革兰阴性肠道杆菌）、肠球菌平板（主要用于分离培养肠球菌）备用。上述标本梯度稀释液分别做3个平板，并置于37℃ CO2孵箱培养24 h，后依次统计各平板菌落数，并计算3个梯度的菌落平均数。根据下列公式对细菌进行定量分析：组织细菌量（cfu／g）＝菌落数×稀释倍数／组织重量。根据菌落形态和革兰染色进行初步鉴定，再由细菌自动分析仪进行菌落鉴定。

1.3 统计分析 统计分析采用SPSS16.0软件进行，正态计量数据以“x±s”表示，多组间单变量对比使用单因素方差分析。

2 结果

2.1 头孢曲松和亚胺培南对脓毒症大鼠肠道杆菌、肠球菌和真菌数量的影响 对测算所得细菌数目均做对数转换，以便进行统计比较。对数转换的底设为10。由表1可知脓毒症未治疗组3种菌落数均高于正常对照组，应用头孢曲松治疗后，3 d组杆菌数量明显降低，与正常对照组和脓毒症未治疗组相比差异显著（P＜0.01），与3 d组类似，7 d组杆菌数量较少，与正常对照组无显著差异，而与脓毒症未治疗组差异显著（P＜0.05）。头孢曲松治疗后，3 d组与7 d组肠球菌数量均显著高于正常对照组和脓毒症未治疗组（P＜0.01）。分析真菌数量发现，3 d组与正常对照组差异显著（P＜0.01），而与脓毒症未治疗组无显著差异；同样，7 d组与正常对照组差异显著（P＜0.05），而与脓毒症未治疗组无显著差异。

亚胺培南治疗后，3 d组杆菌数量与正常对照组和脓毒症未治疗组均无显著差异，而7 d组与正常对照组相比差异显著（P＜0.05）。而亚胺培南治疗后3 d组和7 d组均显著高于正常对照组和脓毒症未治疗组（P＜0.01）。分析真菌检出数量发现，治疗后3 d组和7 d组真菌数量增多，显著高于正常对照组（P＜0.05），而与未治疗组无显著差异。

表1 头孢曲松、亚胺培南对大鼠肠道3种类型菌的数量的影响（lg cfu／g）Tab.1 Effects of ceftriaxone and imipenem on the three types of bacterial（lg cfu／g）

2.2 头孢曲松和亚胺培南对脓毒症大鼠肠道细菌种类的影响

2.2.1 头孢曲松对大鼠肠道细菌种类的影响 由表2可知，正常对照组中仅检出大肠杆菌和粪肠球菌。而脓毒症未治疗组中，新检出少量肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌和变形杆菌，大肠杆菌和粪肠球菌仍保持优势菌种地位。头孢曲松治疗后3 d组，大肠杆菌和粪肠球菌数量减少，其中粪肠球菌检出率由100%减为50%。同时检出少量屎肠球菌，铜绿假单胞菌检出率为62.5%。头孢曲松治疗后7 d组中大肠杆菌数量明显降低，检出率仅为25%。而铜绿假单胞菌数量上升明显，检出率高达87.5%，成为优势菌种。

与脓毒症未治疗组比较，亚胺培南治疗3 d组中，大肠杆菌和粪肠球菌检出率降低，新检出铜绿假单胞菌，阴沟杆菌和屎肠球菌，其中屎肠球菌检出率为87.5%，肺炎克雷伯杆菌和变形杆菌检出率进一步升高。相比亚胺培南治疗3 d组，7 d组中大肠杆菌、铜绿假单胞菌检出率无变化，肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、变形杆菌和屎肠球菌检出率呈现轻微浮动，而粪肠球菌检出率明显降低，同时阴沟杆菌检出率降低为0。

表2 大鼠肠道细菌检出情况Tab.2 rat intestinal bacteria detection

3 讨论

肠道菌群失调及细菌耐药性的产生多是由于广谱抗生素滥用所致。本研究显示，在大鼠脓毒症模型上连续多日应用头孢曲松或亚胺培南均可导致肠道优势菌锐减，而部分条件致病菌成为优势菌群，提示头孢曲松和亚胺培南作为2种临床上常用的广谱抗生素，长期大量使用可导致原籍菌群数量显著减少，同时使得部分条件致病菌如铜绿假单胞菌和屎肠球菌等成为肠道优势菌群，继而引发肠道微生态环境的紊乱。

宿主的原籍菌可阻止外来致病微生物的定植与侵袭［5-6］。肠道共生菌是肠道微生态环境的重要成分，可阻断毒素、细菌等有害物质的入侵，抑制并杀灭外袭致病菌［7-8］。然而目前，细菌耐药性问题日益严重［9］。应用头孢曲松和亚胺培南易引起抗生素附加损害，经常导致危重病患者肠道菌群紊乱。长期使用头孢曲松和亚胺培南，可能选择出耐药菌和条件致病菌，并取代有益菌成为优势菌群［10］。本研究选用头孢曲松和亚胺培南这2种常见广谱抗生素处理经过内毒素注射的大鼠，模拟临床上感染的脓毒症病例，研究头孢曲松和亚胺培南对肠道菌群的影响和变化规律，进而分析细菌对头孢曲松和亚胺培南的耐药性。实验表明，脓毒症未治疗组菌落数（杆菌、球菌和真菌）较正常对照组都有增多的趋势，而头孢曲松治疗3 d组中杆菌数较正常对照组和脓毒症未治疗组显著降低，头孢曲松治疗7 d组相比脓毒症未治疗组下降显著。相反，分析肠球菌和真菌数目时发现2种头孢曲松治疗时间均较对照组明显上升。结合细菌检出情况分析可知，原肠道优势菌大肠杆菌和粪肠球菌数目在头孢曲松治疗会锐减，而检出其他新致病菌，其中铜绿假单胞菌成为优势菌群［11］。分析可知，头孢曲松对大肠杆菌和粪肠球菌等肠道原籍菌具强烈杀灭作用，而新检出的菌群铜绿假单胞菌和阴沟杆菌则呈现出头孢曲松的不同程度耐药性［12］。同时比较分析亚胺培南治疗组与对照组细菌检出情况，发现其严重抑制粪肠球菌的生长，屎肠球菌则对其产生100%耐药性，其他菌群也对亚胺培南表现出不同程度抗性［13］。可见，头孢曲松和亚胺培南2种抗生素表现出对肠道原籍菌的不同抑制作用，且抗生素的抑制作用随处理时间的延长而增强，而新检出的菌群数随处理时间的延长而增多，部分菌群多产生相应的耐药性［14-15］。

综上所述，头孢曲松和亚胺培南易杀灭肠道敏感原籍菌，引起肠道微生态环境破坏，进而造成肠源性感染，加剧了危重病病理生理过程。因而针对不同适应症科学合理的选用抗生素，并严格掌控抗生素的应用时限，可一定程度上减少院内感染的发生率。介于目前细菌耐药性的问题，新型抗生素的筛选与改造及不同抗生素的交叉使用不失为防治细菌耐药性的一种途径，同时针对细菌耐药性的分子机制研究也有望通过分子途径，在基因水平上消除细菌的耐药性。

［1］靳西勇，张永明，李勇.8株耐亚胺培南铜绿假单胞菌基因型的研究［J］.临床军医杂志，2012，40（2）：425-427.

［2］陈德昌，马丽琼，刘绍泽.大黄对脓毒症大鼠肠道细菌及其移位的影响［J］.中国危重病急救医学，2009，21：17-20.

［3］Wilson KH.The microecology of Clostridium difficile［J］.Clin Infect Dis，1993，16 Suppl 4：S214-218.

［4］Schmidt EJ，Boswell JS，Walsh JP，et al.Activities of cholic acidderived antimicrolbial agents againstmultidrug-resistant bacteria［J］.J Antimicrob Chemother，2001，47（5）：671-674.

［5］Vollaard EJ，Clasener HA.Colonization resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38（3）：409-414.

［6］Segal R，Dan M，Eger G，et al.Staphylococcus aureus colonization in the nasopharynx of nasogastric tube-fed patients in a long-term care facility.Eur JClin Microbiol Infect Dis，2009，28（9）：1147-1149.

［7］Smith JL.The role of gastric acid in preventing foodborne disease and how bacteria overcome acid conditions［J］.J Food Prot，2003，66（7）：1292-1303.

［8］陈德昌.重视胃肠道在真菌感染中的作用［J］.内科危急重症杂志，2005，1（1）：21-24.

［9］岳超，赵允召，马炳强.生长激素对脓毒症大鼠肠道细菌易位的影响［J］.肠外与肠内营养，2011，18（2）：106-109.

［10］Hooper LV，Cordon JI.Commensal host-bacterial relationships in the gut［J］.Science，2001，292（5519）：1115.

［11］黄光伟，任爱民，张淑文.大黄对脓毒症大鼠肠道菌群紊乱影响的实验研究［J］.临川和实验医学杂志，2012，11（11）：897-898.

［12］Angus DC，Linde-Zwirble WT，Lidicker J，et a1.Epidemiology of severe sepsis in the United States：analysis of incidence，outcome，and associated costs of care［J］.Crit Care Med.2001，29（7）：1303-1310.

［13］Linde-Zwirble WT，Angus DC.Severe sepsis cpidemiology：sampling selection and society.Crit Care.2004，8（4）：222-6.

［14］韩旭，孔蕴，陈畅，顾黎.细菌对抗生素耐药性的生化机制与对策［J］.中国生化药物杂志，2007，28（5）：353-355.

［15］Dombrovskiy VY，Martin AA，Sunderram J，et a1.Rapid increase in hospitalization andmortality rates for scvcre sepsis in the United States：a trend analysis from l993 to 2003［J］.Crit Care Mcd，2007，35（5）：1244-1250.

（编校：谭玲）

Influence of ceftriaxone and im ipenem to sepsis in the rat intestinal flora and bacterial drug resistance

BIAN Jin-jiong1，ZHOU Zu-mo1，ZHANG Su-jiang2

（1.Department of Infectious Diseases，Zhuji People’s Hospital，Zhuji311800，China；2.Department of infection，Jiangsu Province People’s Hospital，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the influence of ceftriaxone and imipenem to sepsis in the rat intestinal flora and bacterial drug resistance.Methods8 ratswere randomly included in normal control group from 48 healthy SD，and the rest of them were built the endotoxin sepsis model using 15mg／kg intraperitoneal injection of endotoxin.According towhether to apply antibiotics and application deadlines in 24 h aftermodeling，40 rats were randomly subdivided into sepsiswithout treatment group，sepsis ceftriaxone3 d group，sepsis ceftriaxone 7 d group，sepsis imipenem 3 d group and sepsis imipenem 7 d group（n＝8）.During ceftriaxone and imipenem injection treatment，in the corresponding time，colon contents were taken for enterobacteriaceae，enterococcus strains of quantitative culture and bacteria and fungi identification.ResultsAfter treatmentwith antibiotics，the number of rat intestinal bacteria decreased significantly（P＜0.05）.Ceftriaxone selected pseudomonas aeruginosa and enterobacter cloacae，while imipenem selected klebsiella pneumoniae，proteus and excrement enterococcus conditional pathogenic bacteria.All showed the inclination resistance.ConclusionCeftriaxone and imipenem antibiotics could decrease the original bacteria number，so pseudomonas aeruginosa and excrement enterococcus conditional pathogenic bacteria could become advantage bacterium group，causing intestinalmicro ecological environment disruption.

ceftriaxone；imipenem；rats；sepsis；drug resistance

R37

A

1005-1678（2014）03-0034-03

抗生素是由微生物或高等动植物在生长中产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，是具有干扰其他生活细胞发育功能的一类化学物质。抗生素不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体等其它致病微生物也有较好的抑制和杀灭作用。抗生素的开发和应用能够明显降低感染性疾病的死亡率，在治疗严重的传染病和危及生命的细菌感染中非常重要和必要。但临床上滥用广谱抗生素会导致体内微生物菌群的紊乱，大多数敏感菌和正常菌群被抑制或杀灭，但耐药菌则获得生存优势而大量繁殖致病，引发二重感染或重叠感染，并且抗生素的过度使用还可助长细菌的抗药性。近年来，因抗生素滥用而引起多种细菌的耐药性已成为全球备受关注的公共卫生问题［1-2］。脓毒症（sepsis）是指由感染引发的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），临床上常用三代头孢菌素和碳青酶烯类头孢曲松和亚胺培南对其进行治疗，但在治疗过程中出现了体内某些益生菌的严重受抑或死亡以及少数条件致病菌的耐药性和易位［3-4］。本研究通过比较头孢曲松和亚胺培南对脓毒症大鼠肠道中3种主要菌群的影响，进一步探讨其对某些细菌的耐药性，为临床上对病重患者治疗过程中抗生素的合理使用提供科学依据。

2011年度江苏省卫生厅面上科研课题（H201113）

边金泂，男，本科，主治医生，研究方向：感染内科，E-mail：bianjinjiong＠sina.com。