补中益气汤含药血清对A549／DDP细胞PI3K、AKT、Survivin表达的影响

于丹，于宁，易佳丽，唐莹，刘春英Δ

（1.辽宁中医药大学 基础医学院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学 第一临床学院，辽宁 沈阳 110032；3.辽宁卫生职业技术学院 教务处，辽宁 沈阳 110101）

补中益气汤含药血清对A549／DDP细胞PI3K、AKT、Survivin表达的影响

于丹1，于宁2，易佳丽3，唐莹1，刘春英1Δ

（1.辽宁中医药大学 基础医学院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学 第一临床学院，辽宁 沈阳 110032；3.辽宁卫生职业技术学院 教务处，辽宁 沈阳 110101）

目的观察补中益气汤含药血清对肺腺癌耐顺铂细胞株（A549／DDP）磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、丝／苏氨酸蛋白激酶（protein kinase B，AKT）、生存素（Survivin）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。方法制备中剂量补中益气汤含药血清（0.576 g／mL），将A549／DDP细胞分成4组：空白血清组、最佳含药血清组、LY294002组、最佳含药血清组＋LY294002组（即联合组）。采用免疫细胞化学和免疫蛋白印迹法（western blot）方法检测PI3K、AKT和Survivin蛋白的表达。结果最佳含药血清组和联合组PI3K、AKT、Survivin蛋白的表达显著低于空白血清组（P＜0.05），联合组PI3K、AKT、Survivin蛋白减少的更加明显，但与最佳含药血清组相比无统计学差异；LY294002组Survivin蛋白的表达明显低于空白血清对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论补中益气汤含药血清作用于PI3K／AKT信号转导通路，能降低肺腺癌顺铂耐药细胞株PI3K、AKT、Survivin蛋白的表达，提高A549／DDP细胞对顺铂的敏感性。

肺腺癌耐顺铂细胞株；补中益气汤含药血清；磷脂酰肌醇3激酶；丝／苏氨酸蛋白激酶；生存素

1 材料与方法

1.1 实验材料 辽宁中医药大学动物部提供SPF级SD大鼠，体质量（200±20）g，动物许可证号：辽实动质（字）（2012-0012号）。人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549／DDP由中国医科院肿瘤研究中心细胞库提供。

1.2 实验试剂 细胞培养胎牛血清（FBS）、高糖DMEM培养基购于Hyclone公司。美国PI3K、AKT抗体购自南京凯基生物技术有限公司。Triozol Reagent购于美国 Invitrogen Life technologies公司；青霉素由东北制药生产（国药准字H21022424），链霉素购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。鼠抗人Survivin单克隆抗体购于PTGLAB公司，羊抗兔荧光二抗购于凯基生物技术有限公司。

1.3 补中益气汤含药血清制备 根据《方剂学》规定补中益气汤用药剂量（黄芪18 g，白术9 g，柴胡6 g，甘草9 g，人参6 g，当归 3 g，人参6 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白术9 g），按“动物与人体的每千克体重剂量折算系数表”计算大鼠的等效用药剂量。实验所用中药全部购于辽宁中医院。所用药材经冷水浸泡、煮沸过滤2次，于水浴上浓缩待冷去后放入4℃冰箱保存。本次实验采用临床常用人剂量的中剂量按照“动物与人的每千克体重剂量折算系数表”转换成大鼠的中剂量，即含药0.576 g／mL。SD大鼠灌胃给药每日一次，连续3 d，末次给药1 h后，麻醉，腹主动脉采血，无菌管静置30min后，离心，取上清，56℃水浴灭活，过滤除菌，分装，－20℃冰箱冻存备用。

1.4 A549／DDP细胞培养 A549／DDP细胞株在37℃，95%湿度，5%C02条件下培养，含10%胎牛血清高糖DMEM培养液中、含青霉素100U／mL，链霉素100 ug／mL，0.25%胰蛋白酶消化传代，每2天换液一次，每3天传代一次。

2 实验方法

2.1 免疫细胞化学方法检测PI3K、AKT、Survivin蛋白表达

将进入对数生长期A549／DDP细胞随机分为4组：空白血清组、最佳含药血清组、LY294002组、LY294002＋最佳含药血清组（联合组）。分别加入含10%SD大鼠空白血清、10%中剂量补中益气汤含药血清［3］、含浓度为20μM LY294002的10%SD大鼠空白血清和含1μL／100μL LY294002的10%中剂量补中益气汤含药血清。培养48 h后，4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20min，10%山羊血清封闭30min，一抗孵育，4℃过夜，加二抗作用30min，DAB显色，苏木素复染，封片。采用Image Pro Plus医学图像分析系统进行图像分析，在400倍高倍镜下，随机取5个视野，每个视野为2592×1944像素点，分别测出阳性反应细胞的总面和积分光密度，求出平均光密度（average optical density，AOD）。

2.2 免疫印迹法检测 A549／DDP细胞株中 PI3K、AKT、Survivin蛋白的表达 将A549／DDP细胞株随机分为4组，接种于培养瓶中，待细胞贴壁后，具体分组及处理方法参照上述免疫细胞化学法，培养48 h后，提取总蛋白，4℃离心10min，取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度，与5×SDS上样缓冲液煮沸5min，每孔加样10μg，SDS-PAGE凝胶电泳，72 V恒压转移2 h或者35 V转膜过夜，5%的脱脂奶粉封闭2 h。一抗4℃孵育过夜，TBST洗4次，在暗室用ECL发光，图像扫描并分析结果。采用所测蛋白条带与内参条带的光密度比值来表示蛋白的表达水平。

2.3 统计学方法 采用SPSS17.0对数据进行统计学分析。计量资料用“x±s”表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 免疫细胞化学法检测各组A549／DDP细胞PI3K、AKT蛋白的表达 结果显示，PI3K、AKT蛋白的表达具有较高的一致性，空白血清组及LY294002组两种蛋白的表达水平较高，在细胞质内均可见粗大的棕黄色颗粒（见图1、图2）。LY294002组比较空白血清组，测得的AOD值进行数据分析，无统计学意义（见图3）。最佳含药血清组与联合组PI3K、AKT蛋白在细胞内分布均明显减少，仅能看见少量，染色较浅的棕黄颗粒，2组数据分别与空白血清组比较，结果进行统计学分析，P＜0.05，差异均具有统计学意义（见图3）。且联合组较最佳含药血清组PI3K、AKT蛋白减少的更加明显。

图1 各组A549／DDP细胞PI3K蛋白表达的免疫组化结果（×200）Fig.1 Immunohistochemical results of PI3K protein expression in A549／DDP cell（×200）

图2 各组A549／DDP细胞AKT蛋白表达的免疫组化结果（×200）Fig.2 Immunohistochemical results of AKT protein expression in A549／DDP cell（×200）

图3 PI3K、AKT在各组 A549／DDP细胞中的AOD值*P＜0.05，与空白血清组比较Fig.3 AOD value of PI3K and p-AKT in A549／DDP cell*P＜0.05，compared with control serum group

3.2 A549／DDP细胞中 PI3K、AKT蛋白表达情况Western blot结果显示，A549／DDP最佳含药血清组及联合组的PI3K、AKT蛋白表达均明显低于空白血清对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。LY294002组细胞内 PI3K、AKT蛋白表达水平与空白血清对照组相比，差异无统计学意义（见图 4）。

图4 Western blot技术检测A549／DDP细胞PI3K、AKT蛋白的表达1.联合组；2.LY294002组；3.最佳含药血清组；4.空白血清组Fig.4 Expression of PI3K and AKT by western blotmethod

3.3 免疫细胞化学法检测A549／DDP细胞中Survivin表达 Survivin蛋白在细胞膜和细胞浆中均有表达。A549／DDP空白血清组中Survivin表达呈强阳性，可见大量粗大的棕黄色颗粒，颜色较深。最佳含药血清组、LY294002组和联合组，Survivin蛋白表达的较少，棕黄色的颗粒密度较低，颜色较浅，明显低于空白血清对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05，见图5）。联合组Survivin蛋白表达减少的更加明显。各组Survivin蛋白表达的光密度值见图6。

图5 各组A549／DDP细胞Survivin蛋白表达的免疫组化结果（×200）Fig.5 Expression of Survivin in A549／DDP（×200）

图6 PI3K、AKT在各组A549／DDP细胞中的AOD值*P＜0.05，与空白血清组比较Fig.6 AOD for Survivin expression in A549／DDP cell*P＜0.05，compared with control serum group

3.4 Western blot技术检测各组A549／DDP细胞Survivin蛋白的表达 Western blot结果显示，A549／DDP最佳含药血清组、LY294002组及联合组的Survivin蛋白表达均明显低于空白血清对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05，见图7）。

图7 Western blot检测A549／DDP细胞Survivin蛋白的表达1.空白血清组；2.最佳含药血清组；3.LY294002组；4.联合组Fig.7 Expression of Survivin by western blotmethod 1.control serum group；2.the bestmedicated serum group；3.LY294002（blockers）group；4.LY294002＋bestmedicated serum group

4 讨论

肺癌是严重威胁人类生命的恶性肿瘤，全球每年死于肺癌人数超过100万，约85%为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）［7］。化疗是临床常用的治疗手段，而恶性肿瘤对化疗药物的耐药性是肿瘤化疗的主要障碍［8］。如何解决肿瘤对化疗药物的耐药性成为肿瘤治疗中丞待解决的关键问题。补中益气汤有补中益气，升阳举陷之功效。方中黄芪，补益中士，温养脾胃；方中人参、白术、甘草，甘温益气，补益脾胃［9］。临床将补中益气汤应用于肺癌的治疗，能够提高患者免疫力，补气健脾，减轻化疗副反应，有效改善肺癌耐药，提高临床治疗效果［10-11］。

PI3K／Akt信号通路与肺腺癌的细胞增殖、存活、耐药密切相关。PI3K由异源二聚体复合物组成，包括有一个催化亚单位（p110）和调节亚单位（p85）［12］。Akt基因又被称为蛋白激酶 B，是PI3K下游的作用靶点。Akt是化疗耐药的中枢介质，研究表明抑制Akt，阻止Akt的磷酸化，可以中断PI3K／Akt信号通路的转导，降低化疗的耐药性［13-14］，Brognard等［15］报道 PI3K活化的非小细胞肺癌对化疗产生耐药性，应用PI3K的抑制剂可使肺癌细胞对放化疗的敏感性增加。

本研究根据中药血清药理学理论制备补中益气汤含药血清，根据前期的研究结果，采用已筛选出来的最佳换药血清浓度，即10%中剂量的含药血清作用于A549／DDP细胞48 h。免疫细胞化学法和Western blot法结果一致，最佳含药血清组和联合组PI3K、Akt的表达均明显减少，与空白血清对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明补中益气汤含药血清能够有效降低PI3K、Akt蛋白的表达，影响PI3K／Akt信号转导通路。其中联合组较最佳含药血清组PI3K、Akt蛋白减少的更加明显，分析补中益气汤含药血清与LY294002可能存在着协同作用。LY294002是PI3K／Akt信号通路的抑制剂，具有靶向抑制PI3K催化亚基p110的作用，PI3K阻断剂作用于亚基p110，抑制Akt磷酸化，使磷酸化的 Akt（p-Akt）减少［4］，阻断 PI3K／Akt通路在肺癌顺铂耐药中的作用，但对PI3K、Akt这2种蛋白的总体表达影响不大，实验结果也表明LY294002组PI3K、Akt蛋白表达与空白血清对照组相比，2种蛋白的表达并没有明显的变化。

Survivin是凋亡抑制蛋白IPA家族成员，又名存活素，是凋亡抑制最强的因子。直接抑制半胱氨酸天冬氨酸酶-3、半胱氨酸天冬氨酸酶-7（Caspase-3、Caspase-7）的活性［16］，阻断细胞凋亡。Survivin蛋白在正常分化组织中几乎不表达，但在大多数肿瘤组织中表达。有报道，部分肿瘤Survivin的表达与AKT的活性是密切相关的［17］。本实验研究对A549／DDP细胞Survivin蛋白进行定位和定量分析，免疫细胞化学方法和Western blot法结果显示，最佳含药血清组、LY294002组、联合组Survivin蛋白的表达下降，与空白血清对照组对比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明补中益气汤能够有效的降低A549／DDP细胞内Survivin的表达。Survivin作为PI3K／Akt细胞信号通路的下游因子，其表达的下调与PI3K、Akt蛋白表达的减少存在一定的相关性，推测补中益气汤含药血清通过降低PI3K、Akt蛋白的表达进一步调节Survivin活性，以实现逆转肺腺癌顺铂耐药。

综合本实验结果，补中益气汤含药血清以PI3K／Akt信号通路为靶点，下调PI3K、Akt蛋白的表达，进而抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表达以提高A549／DDP细胞对顺铂的敏感性。补中益气汤含药血清降低肺癌顺铂耐药为多靶向，多作用位点，具体机制仍有待于更进一步的研究。

［1］韩仁强，郑荣寿，张思维，等.1989年-2008年中国肺癌发病性别、城乡差异及平均年龄趋势分析［J］.中国肺癌杂志，2013，16（9）：445-451.

［2］Haeusler GM，Mechinaud F，Daley AJ，et al.Antibiotic-resistant gramnegative bacteremia in pediatric oncology patients-risk factors and outcomes［J］.Pediatr Infect Dis J，2013，32（7）：723-726.

［3］易佳丽，刘春英.补中益气汤含药血清干扰A549／DDP细胞生长作用的实验研究［J］.中国医学导报，2013，10（17）：4-6.

［4］刘亚莉，易佳丽.补中益气汤含药血清对A549／DDP细胞PI3K／AKT信号转导通路影响的实验研究［J］.中国医科大学学报，2014，10，（43）：14-16.

［5］Shaw RJ，Cantley LC.Ras.PI3K and mTOR signalling controls tumour cell growth［J］.Nature，2006，441（7092）：424-430.

［6］Krasilnikov MA.Phosphatidylinositol-3 kinase dependentpathways：The role in control of cell growth，survival，and malignant transformation［J］.Biochemistry（Mosc），2000，65（1）：59-67.

［7］牛慧彦，何平.PI3K／Akt／mTOR信号通路在非小细胞肺癌中作用的研究进展［J］.中国全科医学，2007，10（23）：2019-2021.

［8］Friboulet L，Olaussen K A，Pignon JP，etal.ERCC1 isoform expression and DNA repair and in non-small-cell lung cancer［J］.N Engl JMed，2013，368（12）：1101-1110.

［9］朱晓琳，李文林.补中益气汤研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13（11）：104-105.

［10］Guo L，Bai S P，Zhao L，et al.Astragalus polysaccharide injection integrated with vinorelbine and cisplatin for patients with advanced non-small cell lung cancer：effects on quality of life and survival［J］.Med Oncol，2012，29（3）：1656-1662.

［11］刘明，薛芳芳.化疗联合补中益气汤加减治疗中晚期非小细胞肺癌30例［J］.湖南中医杂志，2013，29（5）：42-44.

［12］Hanada M，Feng J，Hemmings BA，Structure，regulation and function of PKB／AKT-a major therapeutic target［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1697（1-2）：3-16.

［13］Schuurbiers OC，Kaanders JH，van der Heijden HF，et al.ThePI3-K／Akt-pathway and radiation resistance mechanisms in non-small cell lung cancer［J］.JThorac Oncol，2009，4（6）：761-767.

［14］王鲁健，孙丽梅.乳腺癌中AKT激活与耐药蛋白表达相关性［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（4）：401-405.

［15］Brognard J，Clark AS，Ni Y，etal.Akt／protein kinase B is constitutively active in non-small cell lung cancer cells and promotescellular survivaland resistance to chemothera-py and radiation［J］.Cancer Res，2001，61（10）：3986-3997.

［16］Tamm I，Wang Y，Sausville，et al.IAP-famClaraily protein survivn inhibits caspase activify and apoptosis indnced by fas（CD95），bax，caspases，and anticancer diugs［J］.CancerRes，1998，58（23）：5315-5320.

［17］陈静.膀胱移行细胞癌Survivin表达与AKT1和Caspase3蛋白活性及转录水平的关系［J］.西南国防医药，2007，17（5）：557-560.

（编校：吴茜）

Effect of Buzhong Yiqi Decoction medicated serum to the expression of PI3K、AKT、Survivin in lung adenocarcinoma cell lines A549／DDP

YU Dan1，YU Ning2，YIJia-li3，TANG Ying1，LIU Chun-ying1Δ

（1.Preclinical Medicine Academy，Liaoning university of traditional Chinesemedicine College，Shenyang 110032，China；
2.The First Clinical Academy，Liaoning university of traditional Chinesemedicine，Shenyang 110032，China；
3.Dean’s Office，Liaoning College of Health Vocational Technology，Shenyang 110101，China）

ObjectiveTo observe the effectof Buzhong Yiqi Decoctionmedicated serum on PI3K、AKT、survivin in lung adenocarcinoma A549／DDP cells，and explore its functionalmechanism.MethodsBuzhong Yiqi Decoction medicated serum ofmiddle dosage（0.576 g／mL）were prepared，and A549／DDP cellswere divided into four groups：blank serum group，the best containingmedicine serum group and LY294002 group（blockers group），the best containing medicine serum＋LY294002 group（combination group）.The protein expression of PI3K，AKT and Survivin were detected by Immunocytochemistry and Western blot.ResultsComparewith blank serum group，the protein expression of PI3K、AKT and Survivin in best containing medicine serum and combination group were significantly lower（P＜0.05），and the later was more lower，but there was no significant differences between best containingmedicine serum and combination group.The expression of survivin in LY294002 group were significantly lower than blank serum group（P＜0.05）.ConclusionBuzhong Yiqi Decoction can reduce the protein expression of PI3K，AKT and surviving，increase the sensitivity of A549／DDP to DDP through PI3K／AKT signal transduction pathway.

A549／DDP；Buzhong Yiqi Decoctionmedicated serum；PI3K；AKT；Survivin

R734.2

A

1005－1678（2014）03－0004－04

肺癌的发病率在世界范围呈明显增高趋势，世界卫生组织报告肺癌将是21世纪危害人类健康最严重的疾病之一［1］。化学药物治疗是综合治疗肺癌的重要手段，但是肺癌细胞对不同化疗药物的耐受，使得非小细胞肺癌的5年生存率不超过20%［2］。中医学认为正气虚损是肺癌顺铂耐药的主要原因，已有研究表明［3-4］，培土生金法可有效干预肺癌顺铂耐药。补中益气汤为培土生金中药代表方剂，临床应用补中益气汤以减轻化疗引起的不良反应，改善肺癌耐药，但机制尚不清楚。磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B信号转导通路在细胞增殖、分化、肿瘤的血管形成和转移等方面起着重要的作用［5］。近几年，已经有大量文献报道PI3K／Akt信号传导通路的异常与肿瘤生长、维持和化疗耐药等方面有关［6］。本研究通过血清药理学方法，观察补中益气汤药对A549／DDP细胞PI3K、Akt及Survivin蛋白表达的影响，以期从分子生物学水平探讨补中益气汤逆转肺癌顺铂耐药的具体机制。

国家自然科学基金资助项目（81072743）

于丹，女，博士生，讲师，研究方向：中药干预肿瘤细胞凋亡，E-mail：yudanzzm＠163.com；刘春英，通信作者，女，教授，博士生导师，研究方向：中药抗肿瘤作用机制研究，E-mail：chunying99＠163.com。