加巴喷丁对骨癌痛模型大鼠的镇痛作用及机制研究

张莹，王志国，孙丹丹，欧阳竟锋，赵小亮，王丹巧，李涛，崔悦，牛晓红

（中国中医科学院 医学实验中心，北京 100700）

加巴喷丁对骨癌痛模型大鼠的镇痛作用及机制研究

张莹，王志国，孙丹丹，欧阳竟锋，赵小亮，王丹巧Δ，李涛，崔悦，牛晓红

（中国中医科学院 医学实验中心，北京 100700）

目的研究加巴喷丁对Walker-256乳腺癌细胞构建的大鼠胫骨转移性癌痛模型的镇痛作用及其机制。方法雌性wistar大鼠30只，随机分为假手术组（sham）、模型组（model）和加巴喷丁组（GBP，100mg／kg），每组10只；分别进行操作对照和胫骨转移性癌痛造模手术。以机械痛缩足域值和影像学观察作为大鼠疼痛行为学的评价指标；分别采用微透析分析仪ISCUSFflexMicrodialysis Analyzer、放射免疫法、流式多因子检测技术，测定脑脊液中谷氨酸（Glutamate，Glu）、脊髓中P物质（Substance P，SP）及肿瘤局部组织中白细胞介素-12／P70（Interleukin-12／p70，IL-12P70）、γ干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）及 β-神经生长因子（β-nerve growth factor，β-NGF）的含量。结果与假手术组相比，手术组胫骨转移性癌痛模型大鼠机械痛缩足域值明显下降，影像学观察到骨质破坏，脑脊液中Glu、脊髓中SP水平明显升高（P＜0.01，P＜0.05），肿瘤组织中IL-12P70、IFN-γ水平明显降低而β-NGF水平明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，加巴喷丁给药后30min大鼠机械痛缩足阈值开始上升，60～300min明显升高（均P＜0.01）。加巴喷丁显著降低了骨癌痛大鼠脑脊液中Glu、脊髓中SP浓度（P＜0.01，P＜0.05），提高了大鼠肿瘤组织中IL-12P70和IFN-γ水平，降低了β-NGF浓度（P＜0.05）。结论加巴喷丁可减轻骨癌痛大鼠的疼痛行为学指标，其镇痛机制可能与抑制中枢兴奋性氨基酸、痛感调质及周围神经生长因子水平、增强外周的免疫作用有关。

加巴喷丁；骨肿瘤；急性疼痛；机械痛缩足阈值；作用机制

本实验采用Walker-256乳腺癌细胞构建大鼠胫骨转移性癌痛模型，观察加巴喷丁对大鼠疼痛行为学的干预作用；采用微透析分析仪ISCUSFflexMicrodialysis Analyzer、放射免疫法和流式多因子检测等技术，测定脑脊液中谷氨酸（Glutamate，Glu）、脊髓中P物质（Substance P，SP）及肿瘤局部组织中白细胞介素-12／P70（Interleukin-12／p70，IL-12P70）、γ干扰素（Interferon-γ，IFN-γ和β-神经生长因子（β-nerve growth factor，β-NGF）的含量，从中枢兴奋性氨基酸、痛感调质及周围神经生长因子、免疫相关因子的角度，探讨加巴喷丁对骨癌痛镇痛作用的中枢和外周机制，为加巴喷丁干预临床最难以控制的骨癌痛提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 瘤株、主要药品及试剂 Walker-256乳腺癌细胞，购自中国协和医科大学基础医学细胞中心；加巴喷丁（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号12031291N0.107）；无菌骨蜡（上海三友医疗器械有限公司，批号 120401）AimPlex®Rat custom 7-plex kit，AimPlex®Mouse／Rat Basic kit，Aimplex®Tissue Lysis Buffer，均购自北京旷博生物技术有限公司；谷氨酸检测试剂盒（瑞典CMA，批号T23423）；SP检测试剂盒（上海第二军医大学，批号20131231）。

1.2 主要仪器设备 51000-20C Von Frey hairs疼痛测试包（美国Danmic公司）；Aimplex®EZPrep洗板仪（北京旷博生物技术有限公司）；MS3数显型振荡器（德国IKA公司）；流式细胞仪BD FACSCalibur（BD Bioscience）；ISCUSflexMicrodialysis Analyzer生化分析仪、数据分析软件 ICU pilot（瑞典 CMA）；DFM-96γ-放射免疫计数仪（合肥众成机电公司）。

1.3 胫骨转移性癌痛大鼠模型的构建及分组 将冻存的瘤株进行复苏、传代，完成腹水瘤细胞的制备并调整细胞浓度为4.7×104个／μL，置于冰盒内备用。Wistar大鼠46只，雌性，体质量180～200 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证编号为SCXK-（军）2007-004，正常饲养。大鼠经适应性刺激后，将连续3 d机械痛缩足阈值≥26 g的大鼠随机挑取10只作为假手术组（sham），剩余36只作为手术组（surgery），参照 Medhurst［4-5］的造模方法，于水合氯醛（3.5 mg／kg）麻醉下，向手术组大鼠右侧后肢胫骨骨髓腔内注入4.5μL含有瘤细胞的腹水，无菌骨蜡封口。假手术组注入同体积的无菌生理盐水。

1.4 胫骨转移性癌痛大鼠模型的行为学评价及药效观察

术后用机械触痛法［6］进行测评，将大鼠扣置于铁丝架上，待其探究活动基本消失后，依次用标准化的von frey纤维丝，从较小刺激强度2 g开始，以1次／s的频率，垂直刺激大鼠右后肢足爪底部中外侧皮肤表面，记录5次中出现3次或3次以上缩足反应的最小刺激量作为大鼠的机械痛缩足阈值，并在术后第13天和21天进行右后肢X线摄片。将术后10～13 d机械痛缩足阈值持续≤8 g兼有X线片骨质破坏的手术组大鼠20只随机分为模型组（model；n＝10）和加巴喷丁组（GBP 100mg／kg；n＝10）。假手术组与模型组均给予等量生理盐水。连续给药7 d后，测评给药前（0min）和给药后30、60、90、120、180、240、300min各时间点的机械痛缩足阈值。

1.5 大鼠脑脊液谷氨酸（Glu）浓度的检测 大鼠于麻醉下，迅速暴露枕骨下缘的环枕膜，将头皮针从枕骨与环枕膜连接处插入到小脑延髓池约0.2 cm，抽取大鼠脑脊液，经高速低温离心，以2μL进样，用ISCUSflex检测仪及专用试剂盒，利用酵素反应、呈色原理，进行自动检测分析。测量波长为365和546 nm；功率为100VA。应用Laptop计算机和LABplotTM软件控制仪器、运算数据及分析结果。

1.6 脊髓组织P物质（SP）的检测 剥离大鼠L4～L6脊髓节段，在生理盐水中煮沸5min，加入1mol／L HAc 1mL，充分匀浆，室温留置100 min。离心后取上清加入相应体积的1 mol／L NaOH。采用平衡饱和加样程序即将非标记抗原（样品与标准品）、抗体、125I标记的抗原依次加入反应管中至其达到动态平衡，再加分离剂分离B（标记的抗原抗体复合物）与F（标记的抗原游离物），γ-放射免疫计数仪测定沉淀的cpm值（B）并绘制标准曲线。

1.7 肿瘤局部组织中IL-12P70、IFN-Υ及β-NGF含量的检测 剥离大鼠右后肢手术钻孔周围肿瘤组织，按每100 mg加500μL预冷的1×AimPlex Tissue Lysis Buffer，充分匀浆，冰浴5min，离心取上清。利用样本中的抗体与微球耦联的特异性抗体、生物素标记的检测抗体、链霉素亲和素标记的PE工作液相结合的原理，将反应好的样品通过流式细胞仪配备的488 nm激发光的PE通道进行荧光检测上机读数。结合抗原标准品的标准曲线，对IL-12P70、IFN-γ、β-NGF进行定量检测。

2 结果

2.1 胫骨转移性癌痛大鼠模型的建立 各组大鼠在术前至术后第6天体重无明显差别，术后第10天开始，手术组大鼠体重增长趋势明显慢于假手术组，分别为（210.63±8.00）g和（222.56±4.30）g。手术组大鼠患肢肿胀，行走步态出现跛行，足趾不能正常外展，保护体位，甚至部分不能使用患肢。术后第12天测机械痛缩足阈值与术前相比显著降低（P＜0.01，见图1）；而假手术组上述指标无明显变化。对机械痛缩足阈值进行连续观察发现，手术组大鼠从术后第9天明显下降，至第21天均稳定维持在（16.45±6.82）g～（10.6±6.51）g，明显低于假手术（P＜0.01，见图2）。X线可见：假手术组大鼠除钻孔点外，未见异常骨质结构；手术组大鼠术后第13天骨质有点状缺损，骨皮质部分膨胀，突破骨膜；术后第21天时，该大鼠右侧后肢肿胀较前明显增加，片状骨溶解，双侧骨皮质均不连续，甚至出现骨折（见图3）。

图1 大鼠胫骨转移性癌痛造模术前和术后机械痛缩足阈值的比较**P＜0.01，与手术组术前相比Fig.1 Comparision of preoperative and postoperative paw withdrawal mechanical threshold on tibiametastatic cancer pain ratsmodel**P＜0.01，compared with preoperative surgery group

图2 大鼠胫骨转移性癌痛造模手术组和假手术组术后机械痛缩足阈值的比较**P＜0.01，与假手术组相比Fig.2 Comparison of paw withdrawalmechanical threshold on tibiametastatic cancer pain ratsmodel betweenr surgery and sham surgery group**P＜0.01，compared with sham group

图3 假手术组与手术组大鼠X线摄片结果Fig.3 The results of X-ray on sham group and surgery group

2.2 加巴喷丁对胫骨转移性癌痛大鼠机械痛缩足阈值的影响 给药第7天反映大鼠疼痛行为学的指标——机械痛缩足阈值测评结果如表1所示。用药前（0min），模型组与加巴喷丁组大鼠机械痛缩足阈值均显著低于假手术组（P＜0.01），模型组与加巴喷丁组组间差异无统计学意义；加巴喷丁组在给药后30min机械痛缩足阈值上升，90min达到药效最高峰（78.44±27.6）g，在观察的300min内持续有效，在60min以后的所有时间点均显著升高了痛域值（P＜0.01）。

表1 加巴喷丁对大鼠机械痛缩足阈值的影响Tab.1 Effects of gabapentin on paw withdrawalmechanical threshold

2.3 加巴喷丁对大鼠脑脊液中谷氨酸（Glu）、脊髓节段P物质（SP）水平的影响 脑脊液中Glu和脊髓中SP为中枢神经系统疼痛相关的递质和调质，与假手术组相比，骨癌痛模型组Glu、SP浓度均显著升高（P＜0.01或P＜0.05）；与模型组比较，给予加巴喷丁干预后，Glu、SP水平均受到不同程度的抑制（P＜0.01或 P＜0.05，见表2）。

表2 加巴喷丁对Glu和SP含量的影响Tab.2 The effects of gabapentin on glutamate of cerebrospinal fluid and substance P in spinal segment

2.4 加巴喷丁对肿瘤局部组织中IL-12P70、IFN-γ、β-NGF的影响 与假手术组比较，模型组大鼠肿瘤组织中IL-12P70和IFN-γ水平显著下降（P＜0.05），表明其免疫状态低下。与模型组比较，加巴喷丁组大鼠IL-12P70和IFN-γ水平均升高（前者P＜0.05，后者无统计学意义），提示加巴喷丁可以一定程度地改善免疫功能。β-NGF为骨癌痛相关的活性因子，与假手术组相比，模型组大鼠的 β-NGF水平由（2.45±3.85）pg／mL升至（44.95±15.43）pg／mL（P＜0.05），加巴喷丁干预后显著降低至（15.76±9.88）pg／mL（P＜0.05，见表3）。

表3 加巴喷丁对肿瘤局部组织中IL-12P70、IFN-γ、β-NGF的影响（pg／mL）Tab.3 The effects of gabapentin on IL-12P70、IFN-γ、β-NGF of tumor local tissue（pg／mL）

3 讨论

迄今为止，癌痛的临床治疗还在延续“三阶梯”止痛疗法，但因药物的成瘾性、耐受性和不良反应等缺点，使40%的患者疼痛得不到有效缓解［7］，严重影响患者的生存质量及癌症的治疗效果。因此，对癌痛镇痛疗效高、不良反应少的新方法、新药物备受关注和期待。加巴喷丁是前期研究证明对慢性疼痛效果良好、不良反应较少的临床用药，对阿片类药物的代谢影响小，在癌痛的联合应用中，增加其它镇痛药物的作用而不产生有害的相互作用。加巴喷丁对NMDA受体有拮抗作用［8］，提高脑内 GABA受体效应水平［9］；通过抑制突触后膜电压依赖型钙离子通道，阻碍疼痛信息的传递［10］，提示了对于临床最为常见、症状最为严重、最难以控制的骨癌痛有效干预的可能性。

本研究采用部分模拟临床骨癌痛症状与发病机制的大鼠胫骨转移性癌痛模型，观察到加巴喷丁明显改善了该模型大鼠的疼痛行为学指标，提高了大鼠的机械痛缩足阈值，在整体水平证实了加巴喷丁可干预骨癌痛的假设。进一步的研究显示，加巴喷丁显著提高了骨癌痛大鼠肿瘤组织中IL-12P70和IFN-γ水平，降低了β-NGF浓度；显著降低了该模型大鼠脑脊液中Glu、脊髓中SP浓度，一定程度反映了加巴喷丁镇痛作用的机制。

骨癌痛的病理机制独特而复杂，至今仍不完全清楚。但大量研究表明，神经系统的外周和中枢敏化直接参与骨癌痛的机制，并且是疼痛产生和维持的主要原因。骨癌组织中的肿瘤和其它间质细胞会分泌多种炎症因子、生长因子及转化因子等，加之周围神经损伤引起的伤害性感受器异常兴奋，直接导致了神经系统外周的敏化效应。外周敏化后的神经信息通过背根神经节、脊髓背角到达高级神经中枢，经过多种神经递质、兴奋性氨基酸、SP、降钙素基因相关肽等的介导调制，使疼痛信息传递神经元的兴奋性增高，敏感性增强，引起中枢的敏化效应，导致痛觉过敏、触诱发痛和自发痛出现，并维持慢性骨癌痛症状。

神经生长因子（NGF）是肿瘤组织分泌的活性因子之一。生理状态下，机体表达的NGF水平较低，但当肿瘤发生或外周神经损伤时NGF产生增加。高浓度的NGF诱导感觉神经元的表型及反应特性发生变化，并与受体结合，诱导SP和降钙素基因相关肽水平的上调［11］，参与骨癌痛的周围敏化机制。本实验观察到的大鼠胫骨转移性癌痛模型肿瘤组织NGF水平升高现象，可能为骨癌组织分泌及继发的局部神经损伤引起；加巴喷丁干预，部分抑制了过多产生的NGF，减轻了周围敏化，使大鼠疼痛行为学指标改善。这与既往使用NGF抗体，通过阻断NGF通路获得抗伤害感受［12］的研究结果相一致。

在骨癌痛的周围机制中，免疫系统的调控也具有非常重要的作用。临床研究发现，癌症伴有癌痛的患者机体免疫水平低下，细胞免疫、体液免疫处于休眠状态，CD3、CD4、CD8、IL-2及IgA、C3、C4等指标异常；疼痛缓解后，这些异常的免疫指标得到恢复。对常规镇痛治疗无效的癌痛病人进行免疫机能调整性治疗后，伴随整体免疫功能的改善，镇痛药的疗效得以发挥，癌痛也有所减轻［13］。本研究中骨癌痛模型组大鼠免疫学指标IL-12P70和IFN-γ的含量减少，一方面可能与肿瘤不断增长、整体免疫力低下有关；另一方面也可能与瘤细胞自身分泌的IL-10和PGE2等抑制性细胞因子，阻碍单核-巨噬细胞和NK细胞活化、抑制巨噬细胞表达MHC II类分子及B7等共刺激分子有关。加巴喷丁干预后，上调了免疫应答，提高了IL-12P70和IFN-γ的水平，可能是其减轻骨癌痛作用的周围机制之一。

SP是一种速激肽，广泛存在于中枢神经系统，是神经中枢参与痛觉传导的重要经递质或调质。疼痛的周围敏化信息传入脊髓，背角的神经元释放SP，后者与NK-1受体结合，引起细胞膜去极化，并促使兴奋性氨基酸Glu过度释放，加速伤害性信息传递，参与致痛机制，增加对疼痛的敏感性。但也有报道认为低剂量的SP尚具有镇痛的作用［14］。Glu是神经中枢内最重要的兴奋性氨基酸递质，直接参与骨癌痛的中枢敏化过程。周围的疼痛信息及SP引起的异常冲动，引起中枢内传入神经纤维末端释放过量的Glu，作用于NMDA受体，引起Na＋、K＋通透性增加和Ca2＋大量内流，产生兴奋性突触后电流，易化突触传递，诱发中枢神经通路产生高度兴奋而达到中枢敏化［15］，引发或维持痛觉过敏、痛觉超敏和自发痛。研究人员于鞘内分别注射SP或Glu均可诱发实验动物痛觉过敏；用辣椒素排空SP或使用Glu受体拮抗剂MK-801均可升高实验动物的痛阈值［16］。本课题组前期研究也显示：坐骨神经部分损伤［17］和切口痛［18］模型大鼠随其机械痛敏和冷痛敏的产生其纹状体细胞外液Glu、脊髓和脑脊液中SP含量明显增加。上述的观点支持本实验的结果及推论：骨癌痛模型大鼠脊髓SP、脑脊液Glu的产生异常增加，而加巴喷丁可能通过抑制中枢神经系统的SP和Glu水平、抑制神经元去极化、降低神经对刺激的敏感性发挥镇痛作用。

综上所述，加巴喷丁具有减轻骨癌痛大鼠疼痛行为的作用，其镇痛机制可能与调整周围和中枢神经系统中重要的活性因子、疼痛相关的递质和调质的水平有关。然而，加巴喷丁在骨癌痛外周和中枢敏化中的具体作用机制，特别是对上述物质的分子调控和信号转导机制尚待进一步研究。

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（编校：吴茜）

Research on the analgesic effect and mechanism of gabapentin on ratsmodel w ith tibia metastatic cancer pain

ZHANG Ying，WANG Zhi-guo，SUN Dan-dan，OU YANG Jing-feng，ZHAO Xiao-liang，WANG Dan-qiaoΔLITao，CUIYue，NIU Xiao-hong

（Medical Experimental Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

ObjectiveTo study the analgesic effectand mechanism of gabapentin on tibiametastatic cancer pain ratmodel constructed by walker-256 breast cancer cells.Methods30 Femalewistar ratswere randomly divided into sham group，modelgroup and GBP group（100mg／kg），each group had 10 rats.Sham operation were used as operation control and tibiametastatic cancer pain operation were done separately.Paw withdrawalmechanical threshold and observation of X-ray were used to evaluate rats’pain behavior.ISCUSbiochemicalmethod，radioimmunoassay，and streamingmulti-factor detection techniquewere used to detect glutamate level of cerebrospinal fluid，substance P level in the spinal cord and expression of IL-12P70，IFN-γ，β-NGF in the tumor tissue.ResultsCompared with sham group，paw withdrawalmechanical threshold of tibia metastatic ratmodel in operaion group were decreased significantly，and X-ray showed bone destruction，the glutamate level of cerebrospinal fluid and substance P level in the spinal cord were increased significantly（P＜0.01 or P＜0.05）.IL-12P70 and IFN-γlevelswere significantly lower andβ-NGF levelwas higher than that in sham group（P＜0.05）.Compared with model group，paw withdrawalmechanical threshold of rats in gabapentin group began to rise in 30min after administration，and peaked in 60～300min（P＜0.01）.Gabapentin reduced the glutamate level of cerebrospinal fluid，substance P level in the spinal cord andβ-NGF level of tumor tissue concentrations significantly（P＜0.01 or P＜0.05），but increased IL-12P70 and IFN-γlevels of tumor tissue.ConclusionGabapentin can relieve the bone cancer pain of ratmodel.Its analgesic mechanism may lie indecreasing the levels of central excitatory amino acids，pain-associated neuromodulator and the nerve growth factor，and enhancing the peripheral immune function.

gabapentin；bone neoplasms；acute pain；paw withdrawalmechanical threshold；mechanism of action

R965.1

A

1005-1678（2014）03-0008-05

加巴喷丁（gabapentin，GBP）分子结构与 γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）相似，在临床上多用作抗癫痫治疗，近年来在神经病理性疼痛方面的应用也逐渐广泛，如带状疱疹后神经痛、三叉神经痛、糖尿病性神经痛等。加巴喷丁与吗啡联合应用于术后镇痛可减少吗啡的用量和不良反应，与氢考酮联合应用于癌症患者的中、重度疼痛可增加氢考酮的镇痛效果，使疼痛进一步缓解［1-2］。但加巴喷丁单独使用对兼有神经病理性疼痛和炎症疼痛双重特征的骨癌痛作用如何尚不清楚［3］。

国家科技部国际科技合作专项（2010DFA31890）；中国中医科学院自主选题研究项目（ZZ2013003）

张莹，女，硕士，研究方向：中西医结合基础，E-mail：rachelzy24＠126.com；王丹巧，通信作者，女，研究员，博士生导师，研究方向：中药药理学与中西医结合基础研究，E-mail：dq_wang96＠sohu.com。