孕鼠暴露低剂量邻苯二甲酸二己酯对仔鼠脂肪分布的影响

刘莉，刘慧敏，顾海伦，赵越，杨军

(1.中国医科大学公共卫生学院 营养与食品卫生学教研室，辽宁 沈阳 110001；2.中国医科大学附属盛京医院 骨外科，辽宁 沈阳 110004)

邻苯二甲酸酯是一种环境内分泌干扰物，主要作为聚氯乙烯塑料的柔软剂用于医药装置、食品包装、儿童玩具等[1]，为人群所广泛接触。关于其研究大多集中在生殖毒性、胚胎毒性等方面，而在脂肪分布方面的研究则较少。流行病学调查显示，脂肪堆积的部位差异与慢性病的发病风险密切相关。脂肪蓄积于臀、股部者罹患糖尿病、高脂血症等慢性疾病的风险较小，而脂肪过多蓄积于内脏者则更倾向于罹患上述疾病。研究发现，邻苯二甲酸酯暴露和腹部肥胖及胰岛素抵抗之间存在联系[2]，提示其可能对肥胖及脂肪分布产生影响。有证据显示，脂肪储存的部位特异性是每个储存部位脂肪细胞特性的内在差异[3]以及它们发育起源趋异的结果[4]。胚胎期邻苯二甲酸酯的暴露可永久改变基因表达模式，影响代谢过程[5]。胚胎发育与模式特异性基因磷脂酰肌醇蛋白聚糖-4(glypican 4，Gpc4)和Tbox-15(Tbx15)的表达具有部位特异性，在人和啮齿类动物的体脂分布方面发挥重要调控作用[6]。因此，本研究拟以邻苯二甲酸酯类中应用最广泛的一种物质邻苯二甲酸二己酯(di-2-ethylhexylphthalate，DEHP)为代表，通过喂饲C57BL/6J孕鼠含有低剂量的DEHP饲料，观察其对仔鼠内脏及皮下脂肪组织Gpc4、Tbx15mRNA表达的影响，为阐明脂肪分布的调控机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

实时荧光定量PCR仪(美国ABI PRISM7500)，高速台式离心机(德国eppendorf centrifuge 5415D)，紫外可见分光光度计(德国Nanophotometer IMPLEN)，超低温冰箱(美国THERMO SCIENTIFIC FORMA 994)。

1.2 试剂

DEHP(美国Sigma公司)，TRIzol(美国Invitrogen公司)，real-time RT-PCR试剂盒(TaKaRa大连宝生物公司)，引物(TaKaRa大连宝生物公司)，液相Erasol(四川天泽基因公司)。

1.3 动物分组

C57BL/6J小鼠(20只雌性，10只雄性)，清洁级，购于中国医科大学实验动物部，动物合格证号SCXK(辽)2008-0005。晚8:00按雄雌鼠比例1∶2合笼，第2天早8:00观察雌鼠阴栓产生情况，有阴栓者为怀孕第1天，将其分为2组。对照组喂饲基础饲料，DEHP组喂饲添加质量分数为0.06% DEHP的基础饲料，直至仔鼠出生。所有孕鼠均自由饮水，每周称质量。仔鼠出生后3周断乳，喂饲基础饲料，出生9周后，处死仔鼠，切取附睾周围(作为内脏脂肪组织的代表)和腹股沟处(作为皮下脂肪组织的代表)脂肪组织，称质量，冻存待测。

1.4 仔鼠附睾和皮下脂肪组织Gpc4、Tbx15 mRNA表达

采用real-time RT-PCR测定mRNA表达：TRIzol提取总RNA，逆转录总反应体系为20 μl[包括5×PrimeScript Buffer 4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl，Oligo dT(50 μmol·L-1)1 μl，Random 6 mers(100 μmol·L-1)1 μl，样品RNA 500 ng，补足RNase Free dH2O至20 μl]；反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。real-time PCR根据说明书进行，总反应体系20 μl[包括SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μl，上游引物(10 μmol·L-1)0.8 μl，下游引物(10 μmol·L-1)0.8 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×)0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6 μl];反应条件为预变性95 ℃ 30 s 1个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环，熔解反应95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。β-actin作为内参基因，数据分析采用2-ΔΔCt法。Gpc4引物序列(169 bp)：上游5′-AGAGCAACGCCCAACCAC-3′，下游5′-GCCA TTCCAGCAGTCATC-3′；Tbx15引物序列(128 bp)：上游5′-AGCTTCTGGAGACACCTGGATGA-3′，下游5′-CGTGGACTCGAGGCTGGTATTTA-3′；β-actin引物序列(171 bp)：上游5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCA AC-3′，下游5′-ATGGAGCCACCGATC CACA-3′。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 孕鼠摄食、产仔情况

结果见表1。

表1两组孕鼠的平均摄食量及产仔情况

Tab1TheaveragefoodintakeandlitterincontrolandDEHPgroup

组 别nDEHP暴露剂量/(mg·kg-1·d-1)平均摄食量/g产仔总数/只对照组306.414DEHP组31206.515

经合笼后共有6只雌鼠怀孕，每组各3只，其余雌鼠弃用。DEHP组孕鼠喂饲含有质量分数为0.06% DEHP的基础饲料，根据其平均摄食量6.5 g计算，其平均DEHP暴露剂量为120 mg·(kg·d)-1。由表1可见，对照组和DEHP组孕鼠产仔情况基本相同，两组孕鼠的平均摄食量无明显差异。

2.2 仔鼠体质量及脂肪分布情况

见表2。

表2两组仔鼠出生9周后体质量、皮下脂肪及附睾脂肪质量

Tab2Thebodyweight，subtaneousandepididymaladiposetissuesweightofmice9weeksafterbirth

组 别n体质量/g皮下脂肪/g附睾脂肪/g对照组1418.01±2.060.05±0.010.20±0.04DEHP组1518.18±2.250.04±0.010.28±0.02a

与对照组相比,aP<0.05

由表2可见，两组小鼠体质量和皮下脂肪质量差异无统计学意义(P>0.05)，DEHP组小鼠附睾脂肪组织质量显著高于对照组(P<0.05)。

2.3 仔鼠附睾与皮下脂肪组织Gpc4 mRNA表达情况

两组小鼠附睾脂肪Gpc4 mRNA表达均显著高于皮下脂肪(P<0.05)，DEHP组小鼠附睾脂肪Gpc4 mRNA显著高于对照组(P<0.01)，在皮下脂肪间无明显差异(P>0.05)。见图1。

与对照组相比,aP<0.01;与皮下脂肪相比,bP<0.05

图1仔鼠附睾与皮下脂肪组织Gpc4mRNA表达情况

Fig1TheexpressionofGpc4mRNAofepididymalandsubtaneousadiposetissuesinmice9weeksafterbirth

2.4 仔鼠附睾与皮下脂肪组织Tbx15 mRNA表达情况

与皮下脂肪相比,aP<0.01;与对照组相比,bP<0.01

图2仔鼠附睾与皮下脂肪组织Tbx15mRNA表达情况

Fig2TheexpressionofTbx15mRNAofepididymalandsubtaneousadiposetissuesinmice9weeksafterbirth

由图2可见，两组小鼠皮下脂肪Tbx15 mRNA表达均显著高于附睾脂肪(P<0.01)，DEHP组小鼠皮下脂肪Tbx15 mRNA表达显著高于对照组(P<0.01)，在附睾脂肪间无明显差异(P>0.05)。

3 讨 论

近年来，肥胖相关的慢性病已经成为危害人类健康的重要公共卫生问题，而脂肪蓄积部位的差异相比于肥胖本身更能影响慢性病的发病风险[7]。有报道邻苯二甲酸酯作为一类环境内分泌干扰物可能会影响脂肪组织的分布，而DEHP作为邻苯二甲酸酯中应用最广泛的一种，受到更多的关注。据文献报道，100 mg·kg-1·d-1剂量被认为低于可引起肝脏过氧化物酶体增殖的最低剂量[8]。本研究中孕鼠的DEHP暴露剂量为120 mg·kg-1·d-1，与文献报道基本接近，结果显示该暴露剂量不影响孕鼠的摄食量及产仔情况。

本研究结果显示，两组子代小鼠体质量虽然相同，但DEHP组小鼠附睾脂肪组织质量显著高于对照组(P<0.05)，说明在胚胎期暴露于一定剂量的DEHP可导致仔鼠脂肪易于向内脏蓄积，影响脂肪组织的分布。DEHP通过何种机制影响脂肪组织的分布，目前还未见相关报道。有证据显示，脂肪储存的部位特异性是每个储存部位脂肪细胞特性的内在差异[3]以及它们发育起源趋异的结果[4]。Gpc4是硫酸乙酰肝素糖蛋白中Gpc家族的成员，在控制细胞生长、分化和形态形成方面发挥关键作用。Tbx15是T-box转录因子家族成员，参与发育过程的调节。研究发现，这两种胚胎发育及模式特异性基因与脂肪分布有关，内脏脂肪组织低水平的Tbx15表达及皮下脂肪组织低水平的Gpc4表达与高腰臀比(腹部肥胖)强烈相关；而皮下脂肪组织高水平的Tbx15表达及内脏脂肪组织高水平的Gpc4表达也与高腰臀比相联系[6]。这提示内脏和皮下脂肪组织Tbx15与Gpc4的表达与脂肪分布有关。本研究发现，给予孕鼠DEHP后，其仔鼠附睾脂肪Gpc4 mRNA表达显著高于对照组(P<0.01)，而皮下脂肪Tbx15 mRNA表达也显著高于对照组(P<0.01)，说明母鼠在孕期接触低剂量DEHP可引起仔鼠内脏或皮下脂肪组织Gpc4和Tbx15表达改变，提示胚胎期低剂量DEHP暴露可能通过改变胚胎发育与模式特异性基因Gpc4和Tbx15的表达，影响脂肪组织的分布，使脂肪更倾向蓄积于内脏。

DEHP具体通过何种机制影响了Gpc4和Tbx15的表达，目前还不清楚。有研究发现，邻苯二甲酸酯类可以诱导大鼠肝脏c-myc基因[9]以及雌激素受体α启动子区[10]的低甲基化，改变其mRNA表达。因此，孕期DEHP暴露可能通过直接影响胚胎Tbx15的甲基化状态而影响其mRNA表达。研究还发现，Gpc4启动子活力高度依赖Sp3和Sp1的表达，在3T3-F442A细胞分化为脂肪细胞的过程中，Gpc4 mRNA的表达高低与Sp3蛋白、Sp3/Sp1的改变相一致，说明这两种转录因子的表达可能是控制脂肪细胞Gpc4表达的决定因素[11]。因此，DEHP可能通过影响Sp3和(或)Sp1表达而改变Gpc4表达。

综上所述，本研究结果提示胚胎期DEHP的暴露可能通过改变内脏及皮下Gpc4和Tbx15 mRNA的表达，影响脂肪组织的分布,其具体的调控机制还需进一步的探讨。进一步的研究包括检测Gpc4和Tbx15蛋白表达；建立仔鼠肥胖模型，观察孕期接触DEHP对子代肥胖发生情况及脂肪分布的影响；检测Tbx15甲基化以及Sp3、Sp1表达情况等。

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