羟基磷灰石纳米管于大鼠股骨肌袋异位成骨的实验研究

王晓波，陈一心，郑欣，郭向可，王骏飞，李东亚，邱旭升，施鸿飞，王杨雨凡

(1.东南大学鼓楼临床医学院 骨科，江苏 南京 210008； 2.南京大学医学院附属鼓楼医院 骨科，江苏 南京 210008； 3.南京大学 化学化工学院，江苏 南京 210008；4.徐州市中心医院 骨科，江苏 徐州 221000)

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是脊椎动物骨骼的主要成分，人体骨中HAP的质量分数占95%以上。人工合成的HAP具有良好的生物相容性、生物活性和骨传导作用，是一种优良的骨组织替代材料[4]。我们前期研究中利用有机胺模拟天然HAP的生物生成过程，成功合成六边形管状结构的单晶体HAP纳米管[5]。体外实验发现，HAP纳米管具有很强的细胞增殖能力，为其作为骨修复材料提供了依据。本研究采用大鼠股骨肌袋内植入HAP纳米管的方法，验证其在生物体内的骨诱导能力，为考证HAP纳米管的临床应用提供动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 HAP纳米管的制备

采用Guo等[5]的方法，水热法合成HAP纳米管，可分成两个部分：将有机胺溶液缓慢滴入Ca(H2PO4)2和CaCl2混合溶液中；6 h行水热法处理并调节溶液pH为8.2，得HAP纳米管。透射电镜(TEM)进行材料晶粒形貌和尺寸观察分析(图1)，其横切面为六边形，管两端开放结构的HAP纳米管，纳米管的内径和外径分别为8～50 nm和20～80 nm。

图1纳米管的示意图及电子显微镜图片a.HAP纳米管的示意图，为图片清晰，氧原子已经移除；b.显示HAP纳米管为横切面正六边形、两端开放的结构，其内径和外径分别为8～50 nm和20～80 nm

Fig1TheschematicdiagramandSEMofHAPnanotubes

1.2 动物实验

10只雄性大鼠，3月龄，平均体重200 g，由南京医科大学动物实验中心提供，已排除先天性畸形、营养不良等疾病。采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，仰卧位，股部皮肤消毒后切开皮肤，暴露股筋膜，钝性分离骨外侧肌形成肌袋，将HAP纳米管粉末约2 g植入右侧肌袋，暴露左侧肌袋不植入材料作为对照。依次缝合肌筋膜和皮肤，碘伏消毒切口。术后连续3 d肌肉注射青霉素40万U。正常喂养。

1.3 大体、影像学观察

记录实验大鼠的进食、活动等一般情况以及切口有无红肿、渗出等表现。术后当天及术后4、8、12周行X线及CT扫描检查，观察有无骨形成、植入区密度影的变化等。

1.4 组织学观察

2 结 果

2.1 大体观察

所有大鼠切口愈合良好，无明显感染表现。1周时植入区有明显淤血肿胀表现；12周时，切开植入区可见组织为硬结节状，边缘不规则，周围肌肉组织颜色与正常相差不大，取组织时明显可见组织包裹的HAP纳米管粉末。

2.2 X线及CT三维成像观察

术后各期X线及CT扫描均未见植入区与骨组织密度相当的高密度影；各期均可见未被吸收的HAP纳米管材料(图2)。

图2大鼠术后及第8周CT扫描三维重建图和X线摄片a.术后当天的CT扫描三维重建图，植入区可见分散的比骨组织密度低的HAP纳米管粉末；b.植入物第8周的CT扫描三维重建图，植入区未见明显高密度影，可见植入侧HAP纳米管粉末聚集；c.植入物第8周X线图，可见植入区有高密度影

2.3 组织学观察

处死后植入区外围可见明显的肌细胞，肌袋内可见大量的植入物成簇排列，并被淋巴细胞包绕，形成类似巢状结构。植入物周围未见软骨细胞成骨、毛细血管生成及HAP纳米管粉末降解(图3)。

3 讨 论

HAP具有较好的生物相容性和生物活性，同时对细胞没有毒性和致癌性，能够满足植入替代骨材料的基本要求。HAP的骨传导性能已被普遍认可，但生物陶瓷载体的性能受原料、制备工艺的影响较大，其在骨骼肌异位成骨中以材料表面新骨沉积为主[6]，因此，若需要利用其修复负重部位骨缺损，则必须使材料达到可进行良好骨替代的要求，从纳米结构上重建材料的晶体微径，可以使HAP获得更优良的生物性能，有望有效替代新生骨组织[7]。它兼具HAP的骨传导和骨诱导能力，同时，纳米级HAP在功能上表现出一些特异性能，如更好的生物相容性、生物活性、生物力学行为和降解吸收等性能[8]。

图3植入区HE染色病理图可见明显炎症反应，淋巴细胞包绕材料形成类似巢状结构，未见明显骨组织

Fig3HEstainingpathologicalpictureofimplantedarea

前期研究中合成的HAP纳米管材料的直径为20～80 nm、长1～20 μm，具有比HAP纳米棒更大的比表面积，可以提高HAP材料的骨传导和骨诱导能力。HAP纳米管生物力学性能不佳，不能单独制作大型植入物固定材料，但其稳定性强，不易被吸收，可用于制作用于骨折固定植入物的表面涂层，使植入物不仅可以防止被腐蚀，同时在纳米管中填充抗生素等能够作为感染性骨缺损良好的植入材料，提高植入材料的骨诱导和抗感染能力。

导致本研究中实验结果阴性的原因可能有：(1) 本实验中并未将HAP纳米管材料与骨髓间充质干细胞混合培养后植入大鼠体内，只是将HAP纳米管粉末置于大鼠股骨肌袋，可能由于肌袋内骨髓间充质干细胞过少或者纳米管捕获能力较差，导致植入区并未捕获到干细胞而导致无法分化成骨；(2) 实验使用的是未经修饰的HAP纳米管粉末，在动物体内的分散性差，可能导致聚集现象而使HAP纳米管成团成簇排列，其比表面积反而变小，致使骨诱导和骨传导能力变小；(3) 可能与实验动物有关，不同的实验动物对材料的验证有区别。Yang等[12]将合成的一种生物陶瓷分别植入狗、猪、羊、兔和鼠的肌肉内和皮下组织，结果发现，肌肉内植入45 d和皮下植入60 d的狗和猪的一些样品内有明显的骨形成，而植入羊、兔和鼠的肌肉或皮下的任何样本内直到120 d均无新骨形成。同样的，Ripamonti[13]发现，HAP在灵长类动物(狒狒)体内的成骨能力明显高于其在其他动物如狗、兔等动物体内的成骨能力。本实验采用的是SD大鼠，可能HAP纳米管对其骨诱导性较差。

HAP纳米管可用于制作骨组织工程支架材料，其与成骨细胞具有较好的生物相容性，可以促进骨细胞的增殖和代谢。后续研究中可将HAP纳米管与骨髓间充质干细胞共培养后制成具有力学结构的生物支架，进行大动物体内等的异位成骨能力研究，来进一步证实HAP纳米管的生物特性。