活性维生素D3通过抑制TRPC6表达发挥糖尿病肾病的保护作用

2014-09-12宋志霞郭银凤周敏张晓良

东南大学学报（医学版） 2014年6期

关键词：造模尿蛋白免疫组化

宋志霞，郭银凤，周敏，张晓良

(东南大学附属中大医院肾内科，江苏南京 210009)

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 模型建立及分组

实验大鼠适应性喂养1周后随机分为：正常对照组(NC组，n=10)、DN组(n=10)和DN加活性维生素D3干预组(DN+VD组，n=10)3组。DN组和DN+VD组腹腔注射STZ 60 mg·kg-1。NC组腹腔注射等量的生理盐水。STZ注射3 d后测血糖>16.7 mmol·L-1证明造模成功。DN+VD组给予活性维生素D30.1 μg·kg-1·d-1灌胃，其余两组大鼠同时给予等体积花生油灌胃。造模成功后6、12、18周检测大鼠血糖、体重、24 h尿蛋白量。于造模后18周末处死大鼠。处死前留取血样本和肾组织标本。实验过程观察大鼠精神状态、活动状况、毛发、体重及排便情况。

1.3 血尿生化指标检查

血糖(Glu)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、钙(Ca)和磷(P)采用全自动生化分析仪测定，24 h尿蛋白量采用双缩脲法测定。

1.4 肾脏病理学检查

1.5 免疫组化检测

石蜡切片脱蜡水化，微波修复抗原，采用SP法免疫组化试剂盒，检测指标包括Podocin、Nephrin和Desmin(1∶200稀释)，DAB显色2～5 min，显微镜下观察，控制着色时间，苏木素复染，所有操作按照说明书进行。每张切片随机选取20个连续不重复视野(400倍)，行半定量分析：无染色(-)，轻度染色(淡黄色，+)，中度染色(棕黄色，++)，重度染色(棕褐色，+++)。参照免疫组化反应结果的判断标准(1996)进行评分。

1.6 免疫荧光观察

1.7 蛋白质印迹法检测

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

NC组大鼠精神状况良好，毛皮有光泽，反应灵敏，活动自如；DN组大鼠精神萎靡，反应迟钝，活动倦怠，毛发杂乱泛黄无光泽，有脱毛现象，尿量多(每天更换垫料1次)，体重下降明显；DN+VD组大鼠精神状态较好，反应较灵敏，毛色可，尿量多，体重较DN组无差异。

2.2 各组大鼠体重及血、尿指标变化

见表1、2。造模成功6～18周，DN组及DN+VD组与NC组相比体重均有所下降，尿蛋白量增多，但是DN+VD组在12周以后尿蛋白的量及肾质量体重比(KW/BW)明显低于DN组。造模18周后，血肾功能指标以及钙、磷等指标3组间无差异。

组别体重/g造模前造模后6周造模后12周造模后18周尿蛋白/mg·(24 h)-1造模前造模后6周造模后12周造模后18周NC组256.14±6.20408.29±27.40527.14±45.32551.00±49.368.83±2.319.71±2.897.62±2.308.91±2.01DN组251.18±13.48235.50±33.53a268.86±57.20a267.17±77.73a7.95±1.8047.55±5.02a54.21±12.64a64.49±4.64aDN+VD组254.71±22.91237.87±34.45a268.20±60.27a250.80±44.24a8.70±3.0136.88±9.74a42.59±7.36ab41.16±3.44ab

a 与NC组比较，P<0.05； b 与DN组比较，P<0.05

组别KW∶BW/g·kg-1Glu/mmol·L-1BUN/mmol·L-1Scr/μmol·L-1Ca/mmol·L-1P/mmol·L-1NC组2.98±0.135.93±0.546.65±0.4249.87±2.562.56±0.432.52±0.21DN组5.43±0.53a27.89±3.12a9.97±2.4352.22±8.212.62±0.222.48±0.23DN+VD组3.65±0.63ab27.47±3.32a9.78±0.4954.03±2.642.70±0.342.38±0.27

a 与NC组比较，P<0.05； b 与DN组比较，P<0.05

2.3 肾组织病理学改变

PAS染色结果显示，DN组肾小球肥大伴系膜基质增生明显，DN+VD组肾小球肥大及系膜基质增生程度均较DN组轻(均P<0.05)；Masson染色3组之间慢性化损伤指标未见差异；电镜下显示，DN组肾小球基底膜增厚，足突融合(箭头所示)，活性维生素D3干预后的DN+VD组上述病变明显减轻。见图1。

a 与NC组比较，P<0.05； b 与DN组比较，P<0.05；n=5

图1各组大鼠肾脏组织病理学改变PAS、Masson×400

Fig1Thechangesofkidneypathologyinthreegroups(PAS,Masson×400)

2.4 活性维生素D3对肾脏足细胞裂隙隔膜蛋白的影响

免疫组化染色结果显示，NC组大鼠大量表达足细胞裂隙隔膜蛋白Podocin以及Nephrin，而DM大鼠表达明显减少。免疫组化半定量分析以及蛋白质印迹结果显示，活性维生素D3干预后的DN+VD组Podocin及Nephrin表达量均高于DN组(P<0.05)，但是仍低于NC组(P<0.05)，见图2、3。

2.5 足细胞损伤标志Desmin表达的变化

NC组大鼠肾脏几乎不表达或低表达Desmin，而DM大鼠肾脏Desmin的表达明显增加(P<0.05)，但活性维生素D3干预后的DN+VD组Desmin的表达明显降低(P<0.05)，见图2、3。

2.6 肾组织中TRPC6的蛋白表达

免疫荧光及蛋白质印迹结果显示，NC组大鼠肾脏几乎不表达或低表达TRPC6，而DM大鼠肾脏TRPC6的表达明显增加(P<0.05),活性维生素D3干预后的DN+VD组TRPC6的表达明显降低(P<0.05)，见图3、4。

a 与NC组比较，P<0.05；b 与DN组比较，P<0.05；n=5

图2各组大鼠肾组织Podocin、Nephrin、Desmin的表达及其半定量结果免疫组化×400

Fig2Theexpressionchangesofpodocin,nephrinanddesminandsemiquantitativeanalysisinrenalineachgroup(Immunohistochemicalstaining×400)

2.7 TRPC6与24 h尿蛋白、Podocin、Nephrin及Desmin的相关性

TRPC6与Podocin(r=-0.808、P<0.05)、Nephrin(r=-0.791，P<0.05)呈负相关，而与24 h尿蛋白(r=0.886，P<0.05)、Desmin(r=0.929，P<0.05)呈正相关，见图5。

3 讨论

最近研究发现，肾小球足细胞损伤是DN早期的重要分子病理特征[7]，但是其损伤的具体机制目前并不是十分清楚。近10余年，随着对足细胞裂孔隔膜蛋白的发现及深入研究，对蛋白尿的发生提出了新的学说。肾小球疾病时可以引起足突融合、裂孔隔膜蛋白如Podocin及Nephrin表达异常，进而导致足细胞结构及功能障碍，产生蛋白尿。Nephrin是特异表达在足细胞裂孔隔膜处的一种跨膜蛋白。以往大量临床及动物实验研究发现，DM状态下肾脏中Nephrin表达下降，且与尿蛋白呈负相关。Nephrin与其他裂隙隔膜蛋白Podocin、CD2AP共定位，以三聚体的形式参与重要的细胞信号转导[8]。Desmin是一种细胞骨架中间丝蛋白，正常情况下仅在系膜细胞少量表达，足细胞不表达，当足细胞受损时，可大量表达[9]，因此可作为反映足细胞损伤的标志蛋白。足细胞上特异蛋白的表达异常是反映其损伤的标志。本实验DN模型PAS染色仅观察到系膜基质的增多及肾小球的肥大，Masson染色3组之间没有差异，进一步证实了该模型在此阶段处于疾病的早期阶段。本研究同时发现，STZ诱导的DM大鼠足细胞Nephrin和Podocin的蛋白表达水平均明显下降，而Desmin表达显著增加(图2、3)。这一结果提示DM大鼠存在足细胞的损伤，与以往的研究结果一致，但是其作用机制尚需进一步阐明。