天麻素预处理对短暂性脑缺血大鼠脑组织S100β表达的影响

赵朝华 吴树强 杨 杰 苟兴春 张军锋 杨吉平 史利利

(西安医学院基础医学研究所，陕西 西安 710021)

研究发现天麻素具有扩张脑血管、提高脑细胞抗缺氧能力、减小脑缺血后梗死体积，抑制细胞凋亡等神经保护作用〔1〕。脑缺血再灌注损伤过程非常复杂，而此损伤发生后 S100β在脑内表达和血清中浓度的改变不仅是脑缺血损伤的重要病理学指标〔2〕，而且其表达量的多少显著影响脑缺血损伤的发展和转归。缺血再灌注后过表达的S100β蛋白对中枢神经系统有毒性作用〔3〕，可加重脑损伤。而天麻素对脑缺血再灌注后S100β的表达有何影响并未见较为系统研究报道。因此，本实验采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型来明确天麻素对S100β的表达的影响，进一步探讨天麻素的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠由西安交通大学医学院动物中心提供，鼠龄8～12 w，体重240～280 g，实验前常规环境分笼饲养至少7 d。天麻素组(n=4)于造模前3 d每日腹腔注射天麻素注射液(中山市三才医药有限公司)100 mg/kg 1次，对照组(n=4)注射等体积生理盐水。参考Longa等〔4〕描述的管腔内线栓技术闭塞右侧大脑中动脉(MACO)诱导建立暂时性局部脑缺血大鼠模型。简要过程：大鼠做颈部前正中切口，分离暴露右侧颈部血管，用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉，将一头端加热呈光滑球形的3-0尼龙线(宁波医用缝线厂)经颈外动脉插入颈内动脉至感到有轻微阻力为止，进线长约18 mm左右。栓塞2 h后轻轻抽出尼龙线至颈外动脉切口处。手术期间使用电热毯维持大鼠体温在36.5～37.5℃。常规环境下饲养。大鼠分别存活1、3和7 d。

1.2方法

1.2.1神经功能学评价 MCAO后2 h参照文献〔5〕方法进行神经功能损伤程度的评定，即0级：行为正常；1级：提尾悬空左侧前肢屈曲，肩内收；2级：抵抗对侧推力下降，伴前肢屈曲；3级：自发性侧向旋转运动，伴抵抗对侧推力下降和前肢屈曲。评定为3级者视为成功脑缺血模型，用于后续实验。

1.2.2S100β免疫组织化学染色 各组于缺血后1、3和7 d分别取大鼠4只，常规灌注固定，断头取脑，石蜡包埋、切片(片厚8 μm)，用于S100β免疫组化染色(S100β单克隆抗体和SABC二抗试剂盒均购自武汉Boster公司)。

1.2.3细胞计数 每只大鼠取4张切片，在20倍物镜下通过Motic Images Advanced 3.0 图像分析系统在缺血边缘区选取4个等面积视野区，计数S100β阳性细胞(胞体完整，呈棕色或棕黑色)数，结果平均后即为1张脑片的S100β阳性细胞数。

1.2.4血清S100β含量测定 动物处死前，均经右心室取血1.5 ml,分离血清，-20℃冻存。所得血清通过ELISA检测S100β含量。操作按试剂盒(第四军医大学生理教研室提供)说明进行。S100β单克隆抗体和S100β多克隆抗体均由自武汉Boster公司提供。

2 结 果

2.1缺血边缘区S100β阳性细胞的形态、数目变化 免疫组织化学染色显示，对照组脑缺血再灌注后1 d S100β阳性细胞在缺血中心区基本消失，偶见形态不完整似将裂解的细胞胞体轮廓，而在缺血边缘区出现许多胞体肥大呈圆形的S100β阳性细胞(20.01±3.87)。天麻素组S100β阳性细胞(16.16±3.59)明显少于对照组(图1)。3 d时对照组为(31.43±3.01)，3 d时缺血边缘区可见大量肥大的S100β阳性细胞，突起增多，数目明显增加(24.39±2.86，图1)。S100β阳性细胞计数结果显示脑缺血再灌注后1 d S100β阳性细胞数目天麻素组均少于对照组(24.39±2.86,P<0.05)。

2.2血清S100β的含量变化 对照组大鼠脑缺血后1 d时血清S100β含量显著升高(正常大鼠血清S100β含量本实验未能测出)，ELISA检测值为(9.12±1.65)μg/L，3 d明显降低，测定值为(2.83±0.98)μg/L，较1 d时有显著性差异(P<0.05)。天麻素组血清S100β含量1 d亦明显增高，检测值为：(6.76±1.97)μg/L，3 d为(1.49±0.88)μg/L。天麻素组的S100β含量均显著低于缺血组(P<0.05)。

对照组1 d

天麻素组1 d

对照组3 d

天麻素组3 d

3 讨 论

脑缺血缺氧可刺激星形胶质细胞活化，产生更多的S100β〔6〕，加上从损伤的胶质细胞漏出的S100β〔7〕，在缺血边缘区将存在高浓度(在μmol范围)的S100β，而高浓度S100β具有神经毒性，可升高神经元内钙离子的浓度，引起钙超载，诱导培养的(AS)表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，并进而生成NO，导致(AS)和培养的神经元死亡〔8〕。高表达的S100β还能促进小胶质细胞分泌白细胞介素(IL)-1，IL-1又能强烈刺激AS活化和增殖，产生大量的S100β〔9〕。S100β自身也能促进AS肥大增殖，产生更多的S100β蛋白，这是一个复杂的链条，S100β在这个复杂的过程中扮演主要角色。大量的动物实验研究表明可能通过以上机制过表达的S100β加重了脑缺血损伤后神经功能缺失及迟发性梗死灶的扩展〔10～12〕。Mori等〔3〕应用高表达S100β的转基因大鼠研究发现，高表达S100β的大鼠较对照组脑梗死体积显著增加，神经功能损伤严重，缺血半暗带胶质瘢痕过度增生。从而更加证实了S100β过表达对脑缺血后神经毒害作用。

本实验结果提示天麻素可能在缺血再灌注早期对S100β的表达有抑制作用。从而可能抑制或减少由于脑缺血损伤后S100β蛋白含量的升高而使脑组织进一步损伤。这可能是天麻素对脑缺血损伤保护作用的另一重要途径。但是具体天麻素如何作用于星形胶质细胞抑制S100β在脑缺血再灌注早期的过表达还有待进一步研究。

4 参考文献

1杨 杰，赵朝华，宗长宏，等.短暂性 MCAO大鼠注射天麻素具有神经保护作用〔J〕.第四军医大学学报，2008；29(4)：295-6.

2Kaca-Orynska M，Tomasiuk R，Friedman A.Neuron-specific enolase and S100B protein as predictors of outcome in ischaemic stroke〔J〕.Neurol Neurochir Pol，2010；44(5)：459-63.

3Mori T,Tan J,Arendash GW，etal.Overexpression of human S100B exacerbates brain damage and periinfarct Gliosis after permanent focal ischemia〔J〕.Stroke，2008；39(7)：2114-21.

4Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1):84-91.

5Martinez G,Carnazza ML.GFAP,S-100 and Vimentin proteins in rat after cerebral post-ischemic reperfusion〔J〕 Int J Devl Neurosci，1998;16(6)：519-26.

6James ML，Blessing R，Phillips-Bute BG，etal.S100B and brain natriuretic peptide predict functional neurological outcome after intracerebral haemorrhage〔J〕.Biomarkers，2009；14(6)：388-94.

7Yardan T，Erenler AK，Baydin A，etal.Usefulness of S100B protein in neurological disorders〔J〕.J Pak Med Assoc.2011;61(3):276-81.

8Adami C，Bianchi R，Pula G，etal.S100B-stimulated NO production by BV-2 microglia is independent of RAGE transducing activity but dependent on RAGE extracellular domain〔J〕.Biochim Biophys Acta，2004;1742(1-3):169-77.

9杨 杰,刘 勇,钱亦华，等.β-淀粉样蛋白诱导大鼠海马S100β表达的作用及机制〔J〕.西安交通大学学报(医学版),2004；25(4):322-5.

10Matsui T，Mori Tetal.Astrocytic activation and delayed infarct expansion after permanent focal ischemia in rats.Part I：enhanced astrocytic synthesis of s-100beta in the periinfarct area precedes delayed infarct expansion〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2002；22(6):711-22.

11Asano T，Mori T.Arundic acid(ONO-2506)ameliorates delayed ischemic brain damage by preventing astrocytic overproduction of S100B〔J〕.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord，2005；4(2):127-42.

12Yasuda Y，Tateishi N.Relationship between S100beta and GFAP expression in astrocytes during infarction and glial scar formation after mild transient ischemia〔J〕.Brain Res，2004；1021(1):20-31.