CA9基因对促进肾透明细胞癌786-O凋亡的作用机制

刘 平 陈志宏 刘金霞

(承德医学院,河北 承德 067000)

肾癌(RCC)是泌尿系统的恶性肿瘤，起源于肾小管上皮，近20年来发病率不断上升，其中肾透明细胞癌(ccRCC)是肾癌的常见发病类型〔1,2〕。RCC发生的确切病因与发病机制仍不清楚，且其生物学行为极其复杂，推断其病因可能是在遗传背景易感性的内在基础上，生物、化学和物理等外在环境因素的持续影响，促进了RCC的发生和发展。CA9是目前癌症生物学界的热门研究基因，该基因是位于P13K/AKT/MTOR通路的下游序列，并与VHL基因的表达产物pVHL和HIF-α存在着密切关系〔3〕。近年的研究发现，CA9对于明确RCC诊断、反应治疗情况及判断预后具有重要价值。本研究以慢病毒转染抑制人CA9基因在ccRCC 786-O细胞的表达，利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察肿瘤细胞生长活性的变化，并应用Western印迹方法检测CA9蛋白和Survivin蛋白的表达变化情况，初步探讨CA9影响RCC生长的可能信号途径。

1 材料与方法

1.1材料 ccRCC 786-O由北京大学泌尿外科研究所提供，5% CO237℃下培养于含10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基中。细胞分为786-O组和786-O转染组进行实验。

1.2主要试剂 CA9 siRNA重组慢病毒(CA9-RNAi-lentivirus)由上海吉凯基因公司提供，CA9 siRNA靶序列：5′-AGTTAAGCCTAAATCAGAA-3′。兔抗人CA9多克隆抗体、兔抗人Survivin单克隆抗体，购自美国CST公司；兔抗人β-actin抗体、碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗兔IgG抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3细胞转染 将5～6万个培养的786-O细胞去血清培养8 h使细胞同步化，将慢病毒液体以1∶10 000细胞数的比例加入到培养皿中，8 h更换含血清的培养基，培养72 h后荧光显微镜下观察转染效率。

1.4MTT法及流式细胞学检测 利用MTT和流式试剂盒检测72 h转染成功的786-O细胞的活力和凋亡情况。786-O细胞用含10%胎牛血清的培养液配成悬液，接种于96孔板，培养1 d后转染慢病毒为对照组。转染12、24、48、72、96 h检测，待检孔加含MTT的单溶液试剂20 μl，37℃，5%CO2的培养箱中孵育4 h，酶标仪在490 nm波长处测吸光度A值，绘制细胞生长曲线，通过A值计算抑制率(IR)，IR=(1-转染组A值/对照组A值)100%。用不应用含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化液消化待测细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次细胞， 500 μl Binding Buffer加入悬浮细胞中，5 μl Annexin V-FITC加入悬液混匀，加入5 μl Propidium Iodide，细胞悬液混匀，于室温、避光环境中反应5～15 min后进行流式细胞仪检测。

1.5Western印迹法检测 提取786-O细胞、转染细胞各40 μg蛋白，加入含β-巯基乙醇的上样缓冲液，沸水中水浴5 min，利用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离电泳，电泳后蛋白电转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉进行封闭，PBS清洗3次，加入兔抗人CA9多克隆抗体、兔抗人Survivin 单克隆抗体和兔抗人β-actin抗体(1∶1 000)，4℃过夜，1×PBS洗膜3次，加AP标记的山羊抗兔IgG二抗孵育杂交，室温下30～60 min，加入显色液显色发光，扫描并分析条带的吸光度值，结果以β-actin的光密度值作为参照。

1.6统计学方法 应用SPSS17.0软件进行分析，转染细胞抑制率和Western印迹检测蛋白表达变化率(%)行单因素方差分析，组间比较采用t检验进行分析。

2 结 果

2.1慢病毒转染786-O细胞变化 利用慢病毒lentivirus-CA9成功转染ccRCC 786-O细胞，72 h后荧光显微镜下观察，可见转染成功的786-O细胞发出绿色荧光，未转染的细胞不发荧光，慢病毒转染后90%以上细胞发出绿色荧光表明病毒转染成功，转染效率高，见图1。

2.2RCC786-O细胞活性及凋亡变化 转染抑制CA9蛋白表达后ccRCC 786-O细胞的生长增殖活性受到明显抑制，凋亡细胞增加，转染组细胞在72 h抑制效率达到最大，比786-O组增殖活力降低61%(P<0.05)。流式细胞检测结果显示转染组肿瘤细胞凋亡增加(23.4±2)%(P<0.05)。见图2。

图1 光镜和荧光显微镜下观察病毒转染ccRCC 786-O细胞(×200)

1)P<0.05,2)P<0.01

图3 Western印迹条带显示CA9蛋白、Survivin蛋白、β-actin蛋白表达情况

2.3Western印迹检测 如图3所示，通过慢病毒转染786-O细胞抑制CA9蛋白的表达，其蛋白抑制效率为(75.2±2)%(P<0.05)。在CA9蛋白表达被抑制后Survivin蛋白水平也出现下降，其蛋白表达下降达到(43.1±3)%(P<0.05)。

3 讨 论

RCC的生物学特性复杂，对放化疗均不敏感，以手术治疗为主〔4，5〕。RCC发生的确切病因与发病机制仍不清楚，近年来，随着分子生物学技术的迅速进展，为RCC的诊断和治疗及预后判断提供了更好的方法。

CA9是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，最早在肿瘤相关的Hela细胞中发现，碳酸酐酶-9(CAIX)为其表达产物，表达于95%的ccRCC。CAIX是一种由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，是大多数RCC中都存在的VHL基因介导表达的酶，可以作为诊断性组织源性标志物，由HIF转录复合体介导，在ccRCC中由于VHL失活而表达上调〔3〕。CA9是诊断RCC最有效的分子标志物之一〔6〕，许多学者已经在多种肿瘤中研究了CA9的表达情况，发现CA9与患者预后不良密切有关〔7〕。研究表明，转移性ccRCC(N+/M+)中CA9的表达明显高于未发生转移的ccRCC(N0M0)；而在未发生转移的肿瘤组，CA9高表达组的生存率明显低于低表达组〔8，9〕。以往研究多只对CA9进行了临床标本检测，少有对其体外研究报道，对CA9影响肾癌生长的信号通路也知之甚少。

本研究通过慢病毒lentivirus-CA9转染肾透明细胞癌786-O细胞系，抑制CA9的表达后发现，786-O细胞的生长和增殖明显受到了抑制，细胞凋亡率增加，提示CA9可能存在调控细胞的增殖和凋亡的信号途径。Survivin作为抗凋亡蛋白家族成员之一，当期被认为是最强的凋亡抑制因子，具有抑制Caspase-3的作用，这一蛋白家族抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl-2家族的作用，在许多肿瘤中呈现高表达〔10〕，可以通过多种途径抑制凋亡，在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。本研究发现，786-O细胞CA9被抑制后，Survivin蛋白的表达水平也随之下降，考虑CA9基因可能通过调控Survivin表达变化从而影响ccRCC细胞的增殖和凋亡，但其具体的机制还需进一步深入研究。

RCC确切病因与发病机制仍不清楚，尽管目前RCC根治术和肾部分切除术已成为治疗早期RCC的有效手段，但在临床上，小恶性实体肿瘤的出现率越来越高，而ccRCC占了全部RCC发生的80%以上，当出现临床症状时，已有1/3的肿瘤患者发生了转移。因此，早期发现和早期诊断RCC无论对于治疗和预后都是至关重要的。通过本研究初步探讨人CA9基因影响肾癌细胞生长的作用机制，为RCC的诊断和治疗提供新的思路。

4 参考文献

1Jemal A, Siegel R, Ward E,etal.Cancer statistics, 2007〔J〕.CA Cancer J Clin, 2007;57 (1):43-66.

2Ljungberg B, Campbell SC, Choi HY,etal.The epidemiology of renal cell carcinoma 〔J〕.Eur Urol, 2011;60(4):615-21.

3Patard JJ, Fergelot P, Karakiewicz PI,etal.Low CAIX expression and absence of VHL gene mutation are associated with tumor aggressiveness and poor survival of clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Int J Cancer,2008;123(2):395-400.

4Wright I, Kapoor A.Current systemic management of metastatic renal cell carcinoma-first line and second line therapy 〔J〕.Curr Opin Support Palliat Care, 2011;5(3):211-21.

5Zustovich F, Lombardi G, Nicoletto O,etal.Second-line therapy for refractory renal-cell carcinoma 〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2012;83(1):112-22.

6Barathova M, Takacova M, Holotnakova T,etal.Alternative splicing variant of the hypoxia marker carbonic anhydrase IX expressed independently of hypoxia and tumour phenotype 〔J〕.Br J Cancer, 2008;98(1):129-36.

7Malentacchi F, Simi L, Nannelli C,etal.Alternative splicing variants of carbonic anhydrase IX in human non-small cell lung cancer 〔J〕.Lung Cancer, 2009;64(3):271-6.

8Zhou GX, Ireland J, Rayman P,etal.Quantifiation of carbonic anhydrase IX expression in serum and tissue of renal cell carcinoma patients using enzyme-linked immunosorbent assay:prognostic and diagnostic potentials 〔J〕.Urology,2010;75(2):257-61.

9Wind TC, Messenger MP, Thompson D,etal.Measuring carbonic anhydrase IX as a hypoxia biomarker:differences in concentrations in serum and plasma using a commercial enzyme-linked immunosorbent assay due to influences of metal ions 〔J〕.Ann Clin Biochem,2011;48 (Pt 2):112-20.

10Shiozaki A, Kataoka K, Fujimura M,etal.Survivin inhibits apoptosis in cytotrophoblasts 〔J〕.Placenta, 2003；24(1):65-76.