子宫颈癌肿瘤干细胞筛选及体外敏感药物试验的临床对比研究

项峰 任利萍 刘克勤 王晓云 张凡 陈江平 舒丽莎

·药物研究·

子宫颈癌肿瘤干细胞筛选及体外敏感药物试验的临床对比研究

项峰 任利萍 刘克勤 王晓云 张凡 陈江平 舒丽莎

MTT法；子宫颈癌；药物筛选试验；流式细胞术；肿瘤干细胞

子宫颈癌的辅助化疗出现耐受导致化疗失败的病例常见，目前研究发现肿瘤干细胞的存在可能导致肿瘤耐药，CD133是多种肿瘤干细胞的标记物，在子宫颈癌的浸润前沿分布密集，本实验利用流式细胞术磁珠方法筛选肿瘤干细胞；同时利用体外药物敏感性试验对临床常用的药物谱进行抗肿瘤药物敏感性试验，利用MTT比色法测定体外肿瘤药敏的平均抑制率。

1 材料与方法

1.1 仪器与药物

1.1.1 仪器:酶标仪(美国BIO-550 ),5%CO2培养箱，微量移液器(芬兰，上海雷勃分析仪器有限公司)，流式细胞仪(BD公司)。

1.1.2 抗肿瘤药物:均从本院药房领取，用生理盐水(其中卡铂、多柔比星、表柔比星需用注射用水)配制成实验液，各种药物的配制浓度分别为：多柔比星(ADM)0.4 mg/ml，表柔比星(e-ADM)0.8 mg/ml,顺铂(DDP) 1 mg/ml，卡铂(CBP) 0.5 mg/ml,甲氨蝶呤(MTX) 0.1 mg/ml，长春新碱(VCR) 0.1 mg/ml,长春地辛(VDS) 40 mg/ml,长春瑞滨(NVB) 0.8 mg/ml，伊立替康(CPT-11) 0.8 mg/ml，拓扑替康(Topotecan) 0.1 mg/ml,依托泊苷(Vp-16) 1 mg/ml，替尼泊苷(VM-26)1 mg/ml,羟基喜树碱(HCPT) 0.5 mg/ml，紫杉醇(Taxol) 0.5 mg/ml,吉西他滨(Gemzar) 3.33 mg/ml，博来霉素(BLM) 0.3 mg/ml，丝裂霉素(MMC)0.1 mg/ml，氟尿嘧啶(5-Fu)1 mg/ml。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠法分选子宫颈癌组织中的肿瘤干细胞:利用眼科剪剪取新鲜子宫颈癌肿瘤组织，剪碎后120目铜网规过滤，去红细胞后制成肿瘤实质组织的原代单细胞悬液，计数并重悬于1 ml 1% FBS-RPMI中，将50 μl已包被CD133一抗的磁珠与预冷细胞悬液1 ml混合，4℃孵育后将细胞悬液置于磁性颗粒分离器中3 min以上，依次收集含有CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的分选液，将分选液离心，去上清液分别收集CD133+和CD133-细胞，PBS离心并洗涤后，用2×105活细胞/ml的浓度接种于6孔板中，继续培养扩增并传代，依此获取足量的CD133阳性细胞。

1.2.2 用MTT法对肿瘤细胞标本进行测定:分别收集CD133+和CD133-对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μl,铺板使待测细胞调密度1 000～10 000孔，5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入不同种类的药物,每孔100 μl,5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置显微镜下观察。每孔加入20 μlMTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h。 终止培养，小心吸去孔内培养液。 每孔加入在酶联免疫检测仪150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。D490 nm处测量各孔的吸光值。

2 结果

2.1 体外药物敏感试验显示多种单药的平均抑制率均大于20%，而临床的有效率多数小于20%，两者的差异在多数药物都比较明显(P<0.05)。见表1。

2.2 不同药物对肿瘤干细胞与肿瘤细胞平均抑制率的对比 多种药物对肿瘤干细胞的敏感性明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；少数药物两者抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨论

肿瘤干细胞(tumor stem cell，TSC)是一群由正常干细胞经演变发生基因异常表达的肿瘤细胞，目前的研究显示肿瘤干细胞的存在与多种肿瘤的多药耐药以及放疗耐受相关。由于肿瘤干细胞具有极强的自身更新能力和经常处于静止期的特性，以及细胞膜高表达多种耐药基因蛋白，便利其逃脱细胞毒药物的杀伤作用，从而使肿瘤在化疗后极易出现局部复发和远处转移。肿瘤干细胞经过基因突变的积累，获得多药耐药机制并遗传下来；或存在基因突变和分化异常导致复发的肿瘤出现了多药耐药性；而且目前的化疗药物多数是细胞周期抑制剂，它们对经常处于静止期肿瘤干的消除无效[1]。因此本实验利用流失细胞术分选子宫颈癌的原代肿瘤干细胞，培养后进行常见临床化疗药物的敏感性筛选，希望为子宫颈癌的个性化治疗提供科学依据。

表1 体外药物敏感试验结果与临床有效率比较

注：与临床有效率比较，*P<0.05

表2 肿瘤干细胞与肿瘤细胞平均抑制率的对比分析 n=59，%

新辅助化疗是子宫颈癌的有效的辅助治疗方式，其主要通过缩小肿瘤原发灶和消除亚临床转移灶达到控制肿瘤发展，降低临床分期，争取手术机会，减少手术风险的目的，但是肿瘤耐药性的存在导致化疗失败，预后不佳。已有的研究显示在多种肿瘤(包括口腔鳞癌、食管癌、乳腺癌等)存在肿瘤干细胞，并且分布较为集中的浸润前沿细胞免疫表型具有其特殊性，此区域肿瘤细胞梭形变明显，粘附性差，分化较低，对放化疗抗拒，是局部复发和治疗失败的关键因素[2,3]。而CD133是目前公认的肿瘤干细胞的特异性标志物，可据此利用流式细胞仪将肿瘤干细胞从肿瘤组织中分离开来。在子宫颈癌肿瘤细胞培养过程中发现，肿瘤干细胞具有很强的自我更新和增殖能力，而CD133阴性细胞不分裂，不增殖。国内的移植瘤研究发现：CD133阳性细胞体内致瘤试验具有较强的致瘤能力，而CD133阴性细胞无致瘤能力。另有研究发现胶质母细胞瘤来源的CD133阳性细胞可以长期保持未分化状态。因此本实验利用流式细胞仪将子宫颈癌的肿瘤干细胞分离并培养研究其与肿瘤细胞在耐药性方面的差异，为筛选敏感药物和制定个性化的化疗方案提供依据。本实验在体外敏感药物筛选中发现肿瘤干细胞标记CD133阳性细胞的耐药性比例明显高于肿瘤细胞，同时肿瘤干细胞在形态方面与肿瘤细胞相比亦存在明显的差别，提示肿瘤干细胞通过细胞表型变化获得耐药性，同时通过细胞形态改变更具侵袭性。

肿瘤化疗的个性化治疗是未来治疗的方向，而测试肿瘤药物敏感性的试验MTT比色法，方法简单、快速、高效、灵敏，重复性较高，现已被广泛应用于体外肿瘤药敏的测定。此种体外筛选实验对指导临床治疗和药物的筛选具有明显的指导意义。根据体外药敏筛选试验结果可指导临床用药，可以提高化疗疗效，提示尽可能减少交叉耐药[4-6]。本实验研究显示体外敏感药物和临床的疗效差异较大，而体外药敏试验阴性药物临床出现耐药几率较少，阴性准确率较高，因而试验结果对于化疗前排除不敏感的抗肿瘤药物非常有价值。同时体外筛选阳性药物与临床用药的差异较大，推测其出现的主要原因在于体外肿瘤细胞生存与体内肿瘤细胞生长的环境差别很大，体内肿瘤细胞与细胞外微环境的相互作用，共同导致耐药的发生，但是体外敏感筛选试验去除了机体免疫以及细胞外微环境对药物的敏感性影响因素。

1 Rasper M,Schfer A,Pionte KG.Aldehyde dehydrogenase 1 positive glioblastoma cells show brain tumor stem cell capacity.Neuro Oncol，2010，12:1024-1033.

2 Yunqing Li,Angela Li,Martin Glas.c-Met signaling induces a reprogramming network and supports the glioblastoma stem-like phenotype Proc Natl Acad Sci USA，2011，108:9951-9956.

3 Manran L,Toshiyuki S,Mathew C.Casimiro.The canonical NF-κB pathway governs mammary tumorigenesis in transgenic mice and tumor stem cell expansion.Cancer Res，2010，70:10464-10473.

4 Lin C,Shideng B,Jeremy N.Rich.Potential Therapeutic Implications of Cancer Stem Cells in Glioblastoma.Biochem Pharmacol，2010，80:654-665.

5 Peisu Z,Justin D,William A,et al.Squelching Glioblastoma Stem Cells by Targeting REST for Proteasomal Degradation.Trends Neurosci，2009，32:559-565.

6 Christine L，C Ines B,Christina S.Normal and neoplastic nonstem cells can spontaneously convert to a stem-like state.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108:7950-7955.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.058

075000 河北省张家口市，河北北方学院附属第一医院

R 711.74

A

1002-7386(2014)02-0285-03

2013-10-18)