丹参酮ⅡA对压力负荷增加大鼠心肌NF-κB表达的影响

蔡辉 蔡佳宇 常文静 赵智明 董晓蕾 赵凌杰

·论著·

丹参酮ⅡA对压力负荷增加大鼠心肌NF-κB表达的影响

蔡辉 蔡佳宇 常文静 赵智明 董晓蕾 赵凌杰

目的 观察丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，TanⅡA)对压力负荷增加大鼠心肌组织核因子-κB(NF-κB)表达的影响，并探讨其对心肌纤维化的保护作用。方法采用腹主动脉缩窄术制备压力负荷心肌纤维化模型，术后存活32只大鼠随机分成4组(n=8)，假手术组、模型组、TanⅡA组(20 mg·kg-1·d-1)及阳性对照药物卡托普利组(100 mg·kg-1·d-1)。术后4周成功造模并开始给药，疗程为4周。8周后检测左心室重量指数、心肌组织病理学、心肌羟脯氨酸含量以及心肌组织NF-κB p65 蛋白含量。结果与假手术组比较，模型组大鼠心室治疗指数和左心室质量指数明显升高(P< 0.01)；与模型组比较，TanⅡA则显著降低(P<0.01)。与假手术组比较，模型组大鼠心肌羟脯氨酸含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，TanⅡA组则显著降低(P<0.01)。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织NF-κB p65 表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，TanⅡA组则显著降低(P<0.01)。结论TanⅡA能抑制心肌肥厚，减轻心肌纤维化，此作用可能与部分下调NF-κB表达有关。

丹参酮ⅡA；压力负荷；心肌纤维化； 核因子-κB

压力负荷增加能激发心肌短暂的炎性反应，诱导促炎细胞因子表达，介导心肌纤维化[1]。NF-κB作为一种核转录因子，可诱导细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的转录，进一步促进炎症和纤维化反应，参与心室重构的进展[2]。丹参酮ⅡA作为传统中药丹参的脂溶性有效成分，已被广泛应用于临床治疗心血管疾病。研究证明，丹参酮ⅡA能有效地抑制大鼠心脏成纤维细胞增殖和表型转化，减少细胞外基质产生，延缓心肌纤维化[3，4]，但其具体作用机制仍需进一步阐明。本研究通过建立腹主动脉缩窄术制备压力负荷增加心肌纤维化模型，在体观察NF-κB p65蛋白在压力负荷增加大鼠心肌中的表达，以及丹参酮ⅡA对压力负荷增加大鼠心肌纤维化的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级6周龄SD大鼠60只，雄性，体重160～200 g [许可证号：SYXK(苏)2003-0032]，由南京军区南京总医院动物实验中心提供。动物饲养室温为(23±3)℃，周期光照8∶00～20∶00，饲料、垫料高压灭菌，常规饲料喂养，自由进食、饮水。

1.2 药品与试剂 丹参酮Ⅱ A磺酸钠注射剂，2 ml∶10 mg，上海第一生化药业有限公司生产；卡托普利片，12.5 mg/片，中美上海施贵宝制药有限公司；羟脯氨酸测定试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；NF-κB p65一抗，武汉博士德有限公司；DAB 显色剂、MaxvisionTM购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌纤维化模型制备：采用Anversa等[5]所用方法用腹主动脉缩窄术制备压力负荷心肌纤维化模型。大鼠适应性喂养5 d后，术前禁食12 h，自由饮水，将手术组用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，固定，剃毛，常规备皮消毒后，于剑突下沿腹正中线逐层开腹，在肾动脉上方分离腹主动脉，在肾动脉上方0.5 cm用内径0.70 mm银夹夹闭，使腹主动脉缩窄60%～70%，确认无出血，将脏器复位后逐层关闭腹腔，术后给予青霉素10万U/kg肌内注射抗感染3 d，6 h后恢复饮食。假手术组不结扎腹主动脉，余处理同上，术后观察4周。造模成功标准为：大鼠的心脏质量指数(HWI=HW/BW)和左心室质量指数(LVWI=LVW/BW)均明显升高。

1.3.2 给药及分组：取术后存活大鼠32只随机分4组，每组8只：假手术组、模型组(10 mg·kg-1·d-1，腹腔注射)、丹参酮ⅡA组(20 mg·kg-1·d-1，腹腔注射)及卡托普利组(100 mg·kg-1·d-1，灌胃)。4组每天上午给药1次，连续给药4周，观察大鼠的饮食、毛色、活动、水肿等一般性状，每周称体重(BW)。

1.3.3 心脏质量指数和左心室质量指数测定：术后8周末，禁食12 h，将5组大鼠称重后采用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，取血完毕后，迅速开胸摘取心脏，于4℃ 0.9%氯化钠溶液中洗去血液，滤纸吸干，除去心脏周围组织和大血管，称取心脏重量(HW)，再剪去左右心房、右心室游离壁保留左心室及室间隔，称取左心室重量(LVW)。分别计算心脏重量指数(HWI=HW/BW)和左心室重量指数(LVWI=LVW/BW)，以HWI和LVWI作为判断心肌肥厚的指标。透壁剪取左心室心尖部分组织投入液氮中留待检测其他指标，其余标本放于4℃的4%多聚甲醛中固定。

1.3.4 病理形态学检测：心肌标本于甲醛中固定24 h后，常规取材、脱水、石蜡包埋，沿左室长轴线每隔1 mm横断面切取数张4 μm厚的切片，作HE和Masson染色。光学显微镜观察心肌组织形态学改变及胶原沉积情况。

1.3.5 大鼠心肌组织羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)检测：心肌组织中HYP的含量可用于估测心肌组织中的胶原水平，即心肌纤维化程度。采用化学比色法测定大鼠心肌组织中HYP含量，严格按照试剂盒说明书操作，心肌组织蛋白定量采用改良Lowry’s法。

1.3.6 Maxvision免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡至水，高温高压抗原修复，喷气后计时2 min，自然冷却，水洗，用PBS冲洗1次，1 min，除去PBS，每张切片滴加50 μl 3% H2O2溶液，室温下孵育10 min，PBS 冲洗3 次，每次1 min，除去PBS，每张切片滴加50 μl一抗NF-κB p65，37℃孵育1 h，每次1 min，除去PBS，滴加50 μl辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育10 min；PBS冲洗3次，每次1 min，除去PBS，滴加50 μl MaxvisionTM试剂，室温下孵育10 min；PBS冲洗3次，每次1 min，除去PBS，滴加50 ul新鲜配制的显色剂(DAB)，室温下孵育10 min；自来水冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。DAB显色阳性表达为棕色。每份标本随机选取5 个高倍视野(×400倍)，采用Image-pro Plus Version 6.0软件进行图像分析，结果以平均光密度(MD)表示。

2 结果

2.1 大鼠一般状态 术前60只大鼠，50只大鼠进行腹主动脉缩窄术，造模4周时，手术组大鼠有18只死亡，主要死因为严重心力衰竭，至实验结束时，未再出现大鼠死亡。随机选取24只分为3组(n=8)：模型组、丹参酮ⅡA组和卡托普利组。假手术组存活10只，随机选取8只。术后第1周4组动物均精神萎靡，活动量减少，毛色暗淡，摄食及饮水减少，1周后好转。整个实验期间，假手术组大鼠一般状况良好，对外界刺激反应灵敏，行动敏捷，毛色光泽，摄食及饮水正常，与术前未见明显差别；模型组大鼠后期精神萎靡，行动迟缓，倦卧，毛色逐渐失去光泽；而丹参酮ⅡA组和卡托普利组大鼠的一般状况较模型组明显好转。4组大鼠均未出现呼吸困难、水肿、进食困难、尿少等心力衰竭症状。

2.2 HWI和LVWI结果 与假手术组比较，模型组的HWI和LVWI均显著增大(P< 0.01)；与模型组比较，丹参酮ⅡA组和卡托普利组的HWI和LVWI下降均显著下降(P< 0.01)。见表1。

组别HWILVWI假手术组2．63±0．132．08±0．11模型组3．23±0．25∗2．75±0．20∗卡托普利组2．82±0．32#2．29±0．29#丹参酮ⅡA组2．88±0．20#2．36±0．20#

注：与假手术组比较，*P<0.01;与模型组比较，#P<0.01

2.3 心肌组织HE染色结果 光镜下观察可见：假手术组大鼠心肌纤维排列整齐，横纹明显，胞核结构清晰，无细胞肿胀，心肌间质及微血管结果正常；模型组大鼠心肌纤维明显增粗，排列紊乱、部分心肌细胞水肿、浅染，横纹模糊，偶见心肌断裂，肌束间隙呈不同程度增大，胞核固缩，部分出现局灶性、片状坏死，间质可见炎性细胞浸润；丹参酮ⅡA组和卡托普利组均有不用程度改善。

A: 假手术组； B: 模型组； C: 卡托普利组； D: 丹参酮ⅡA组；

图1 4组大鼠心肌HE染色

2.4 心肌羟脯氨酸含量检测 造模8周时，与假手术组比较，模型组心肌HYP含量水平明显增高(P<0.01)，提示压力负荷增加大鼠心肌胶原总量升高；与模型组比较，丹参酮ⅡA组和卡托普利组HYP表达水平显著降低(P<0.01)。见表2。

2.5 大鼠心肌NF-κB p65蛋白的表达 造模8周时，免疫组织化学法检测大鼠心肌NF-κB p65蛋白表达水平，NF-κB p65蛋白阳性成分为棕褐色，在心肌细胞显著高表达，在炎性细胞和内皮细胞也有表达。与假手术组比较，模型组NF-κB p65蛋白表达水平增高(P<0.01)。与模型组比较，丹参酮ⅡA组和卡托普利组下降更明显(P<0.01)。见表2、图2。

假手术组 模型组 卡托普利组 丹参酮Ⅱ A组

图2 4组大鼠心肌NF-κB p65蛋白表达

组别HYP(μg/g)NF⁃κBp65(MD)假手术组457±1250．0812±0．0053模型组758±145∗0．0354±0．0066∗卡托普利组483±29#0．0443±0．0057#丹参酮ⅡA组521±141#0．0162±0．0062#

注：与假手术组比较，*P<0.01; 与模型组比较，#P<0.01

3 讨论

心室重构涉及心脏细胞和间质的基因、分子和细胞的改变，包括心脏扩张、间质纤维化以及心脏收缩和舒张功能下降[6]。心脏结构的主要变化是心脏肥厚和心肌纤维化。心脏肥厚的程度与心力衰竭患者的病死率密切相关。在心室重构模型中，HMI是评估心脏肥厚程度的主要指标[6]。在本研究中，用HMI和LVMI显著增加来评估心脏肥厚的程度，而丹参酮ⅡA能显著减轻心脏肥厚。

在心室重构的过程中，大量的胶原分泌并聚集在心肌间质和血管周围。胶原分泌的增加和聚合导致心肌僵硬度增加、心肌结构的改变、心室重构的发生，并最终导致心室功能障碍[7]。因此，抑制心肌纤维化能改善心脏功能。本研究显示，丹参酮ⅡA能显著减轻心肌HYP含量，即心肌胶原含量。因此，我们推测，丹参酮ⅡA能减少胶原分泌和合成，阻止心肌纤维化，延缓心室重构和心力衰竭进程。

心肌细胞坏死激活先天免疫促发一个强大的炎症反应，最终导致修复性反应。尽管压力负荷增加不能导致心肌细胞坏死，但也能诱导心肌细胞炎性反应。神经内分泌激活通过活性氧的产生和NF-κB系统的活化直接刺激炎症反应，血管紧张素Ⅱ和醛固酮也可增强NF-κB活性，直接刺激心肌炎症反应，此外，压力负荷增加还可通过活化基质金属蛋改变诱导心肌细胞外基质[8]。

在正常心脏组织中，NF-κB与它特异性抑制剂IκBα结合，可以防止NF-κB活化，压力或容量负荷增加引发多种途径介导细胞应激能激活IκBα激酶，进而使IκBα磷酸化，从而释放NF-κB，使NF-κB转变成转录活性[9]。尽管NF-κB本身并不是激活胶原转录所必须的，但它能间接增加基质金属蛋白酶的表达，尤其是明胶酶基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9[10]；NF-κB通路还可上调结缔组织生长因子的表达而促进纤维化的发生与发展[11]。在本研究中，免疫组化染色显示，压力负荷增加可诱导NF-κB p65阳性表达在心肌和间质均有表达，这提示压力负荷增加不仅仅诱导心肌细胞表达NF-κB，而且心肌间质也有表达；给予TanⅡA 4周后，NF-κB p65蛋白的表达显著下调。这些研究结果提示，抑制NF-κB p65可显著减少心肌胶原合成，降低心肌胶原含量，减轻心肌纤维化，进而改善压力负荷增加大鼠左心室重构。因此，我们认为丹参酮ⅡA能通过抑制NF-κB p65的表达而有效地延缓或防止心肌纤维化的发生。

综上所述，NF-κB p65在心肌纤维化的发生和发展过程中起着重要作用。丹参酮ⅡA可降低心室质量指数和左心室重量指数，抑制心脏肥厚和心肌间质胶原合成，减轻心肌纤维化和心室重塑，改善压力负荷大鼠心肌纤维化，其作用可能与部分抑制NF-κB p65表达有关。抑制NF-κB 信号将为心肌纤维化的防治提供新的途径。

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EffectoftanshinoneⅡAonexpressionofmyocardialNF-κBinratswithpressureoverload

CAIHui，CAIJiayu，CHANGWenjing,etal.DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,GeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing210002,China

ObjectiveTo observe the effect of tanshinone ⅡA (Tan Ⅱ A) on expression of myocardial NF-κB in rats with pressure overload,and to explore its protective effects on myocardial fibrosis.MethodsThe pressure overload myocardial fibrosis models were established by abdominal aorta constriction in Sprague-Dawley (SD) rats,these rats were randomly divided into four groups:sham-operation group,model group,Tan Ⅱ A group (20mg·kg-1·d-1) and positive control group (captopril 100mg·kg-1·d-1),with 8 rats in each group.4 weeks after the operation,the animal models were successfully established,then the rats were given drugs,with a course of 4 weeks.After 8 weeks,left ventricular mass index,myocardial tissue pathological changes,myocardial hydroxyproline content,myocardial NF-κB p65 expression were detected in rats of the four groups.ResultsAs compared with those in sham-operation group,cardiac mass index and left ventricular mass index were significantly increased in model group (P<0.01); as compared with those in model group,these indexes were obviously decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).As compared with that in sham-operation group,myocardial hydroxyproline content was significantly increased in model group (P<0.01),however,as compared with that in model group,myocardial hydroxyproline content was obviously decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).As compared with those in sham-operation group,NF-κB p65 protein expression levels in myocardial tissues were significantly increased in model group (P<0.01),however,as compared with those in model group,which were significantly decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).ConclusionTan Ⅱ A can inhibit cardiac hypertrophy,relieve myocardial fibrosis,and the effect may be related to down-regulation of the expression of NF-κB.

tanshinone ⅡA;pressure overload; myocardial fibrosis; NF-κB

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.006

项目来源：南京军区南京总医院科研基金面上课题(编号：2010Q027)

210002 南京市，南京军区南京总医院中西医结合科

R 542.23

A

1002-7386(2014)02-0180-04

2013-09-11)