吡柔比星在骨肉瘤细胞放射增敏中的作用研究

许新明 王莉 刘明 徐袁秋

·论著·

吡柔比星在骨肉瘤细胞放射增敏中的作用研究

许新明 王莉 刘明 徐袁秋

目的 研究吡柔比星在骨肉瘤细胞MG-63的放射增敏中的作用。方法用MTT法检测不同浓度吡柔比星对对数生长期的MG-63细胞的抑制作用，确定IC10的数值，作为实验的药物浓度。用克隆形成分析法测定MG-63细胞在IC10浓度吡柔比星作用24 h后给予不同剂量(0、2、4、6、8Gy)照射以及IC10浓度紫杉醇作用不同时间(12、24、36 h)后给予一定剂量射线照射的存活分数(SF)，拟合细胞生存曲线并计算放射增敏比，分析吡柔比星作用于MG-63细胞不同时间(12、24、36 h)后细胞生存率的变化。结果不同浓度吡柔比星作用24 h后，MG-63细胞抑制率逐渐增高(P<0.01)，其药物毒性呈浓度依赖性，IC10为0.004 μg/ml。IC10浓度吡柔比星増敏比分别1.49(D0比)、1.06(Dq比)和1.04(SF2比)，MG-63细胞α/β值为2.23，IC10浓度吡柔比星作用后为0.27。IC10浓度吡柔比星作用于MG-63细胞不同时间后再进行照射，细胞存活分数随时间延长逐渐降低(P<0.01)。结论吡柔比星对MG-63细胞有放射增敏作用，在一定时间内与药物作用时间呈正相关。

吡柔比星；骨肉瘤；放射增敏

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常见的原发骨肿瘤，主要发病于青少年[1]，5年生存率为70%左右，治疗方法主要为手术和化疗[2]。但是有约20%患者骨肉瘤生长在脊柱、骨盆等手术不易切除的部位[1]。对于这些患者，放射治疗显得尤为必要。吡柔比星是治疗肿瘤的一种常见药物，广泛用于恶性淋巴瘤、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤的治疗中[3,4]，对骨肉瘤的治疗亦有较好的疗效[5]。本研究主要目的即观察吡柔比星对骨肉瘤细胞的放射增敏效果及其与药物作用时间的关系，以期为临床应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药物和试剂 本研究所用骨肉瘤细胞株MG-63由河北医科大学第三医院实验中心提供，为单层贴壁生长；吡柔比星由浙江海正药业公司生产(生产批号：121201)；DMEM和胎牛血清购自HyClone公司；噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)由购自Solarbio公司。

1.2 细胞培养 采用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养液，置于含5%CO2、37℃恒温的培养箱培养，0.25%胰酶消化、传代，取对数生长的细胞进行实验。

1.3 照射条件及方法 采用直线加速器(Varian IX)产生的6 MV X线进行照射，剂量率为300 cGy/min，细胞面覆盖硅胶与放射源距离为100 cm，室温下照射。

1.4 实验方法

1.4.1 MTT实验：将对数生长期的细胞用胰酶消化后调整细胞密度至3×104/ml，接种于96孔培养板，每组6个复孔，每孔100 μl，培养12～16 h至细胞贴壁，将吡柔比星按比例稀释加入96孔板，同时设对照组及调零孔。置37℃培养箱培养24 h后每孔加入新鲜配制的MTT(5 mg/ml)15 μl，再次孵育4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，震荡10 min，于酶标仪上测定各孔吸光度(测定波长520 nm)并计算IC10。实验重复3遍。细胞抑制率=(1-A加药/A对照)×100%。

1.4.2 克隆形成分析实验：将细胞常规消化后分别按不同照射剂量以不同密度接种于6孔板，培养12～16 h至贴壁，按分组要求加入药物、进行照射，照射完成后于37℃培养箱培养10～14 d，取出培养板，弃去培养基，PBS清洗2遍，无水乙醇固定15 min，去除固定液，结晶紫色30 min，对含50个细胞以上的克隆进行计数，计算克隆形成率及细胞存活分数。克隆形成率(PE)=克隆数/接种的细胞数，细胞的存活分数(SF)=处理细胞克隆形成率(PE处)/对照细胞克隆形成率(PE对)。

1.5 实验内容及分组

1.5.1 细胞生长抑制实验：采用MTT法进行检测不同浓度药物对MG-63细胞的生长抑制作用。按药物浓度不同分为7组，分别为：0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10和100 μg/ml，同时设对照组。

1.5.2 采用克隆形成分析法测定药物放射增敏性：根据前期MTT法测的结果，以IC10(0.004 μg/ml)作为吡柔比星实验浓度，实验分为单纯照射组(照射剂量分别为0、2、4、6和8 Gy)和药物作用24 h后照射组(照射剂量同单纯照射组)。

1.5.3 采用克隆形成分析法测定最佳照射时间：将接种好的细胞分为对照组、吡柔比星12 h+照射组、吡柔比星24 h+照射组、吡柔比星36 h+照射组，吡柔比星浓度为0.004 μg/ml，照射剂量为4 Gy。

1.6 统计学分析 多组间比较采用单因素方差分析进行统计；细胞存活曲线采用多靶单击数学模型SF=1-(1-e(-D/D0))N进行拟合，Dq=D0·lnN，求出平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq)和照射剂量为2Gy的存活分数(SF2)，根据曲线参数计算增敏比(SER)，SER分别用D0比、Dq比和SF2比表示(D0比=单照射D0/处理D0，Dq比=单照射Dq/处理Dq，SF2比=单照射SF2/处理SF2)；采用SPSS 13.0及Origin Pro 8.5软件，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测不同浓度吡柔比星对MG-63细胞的生长抑制作用 采用不同浓度吡柔比星作用24 h后MG-63细胞存活情况可见，随着吡柔比星浓度的增高，细胞生长抑制率增加(F=202.60，P<0.01)，当药物浓度达到100 μg/ml时，其增殖抑制率达到88.49%，显示出较强的增殖抑制作用。其药物毒性呈浓度依赖性，IC10为0.004 μg/ml。见表1、图1。

浓度(μg/ml)吸光度细胞抑制率(%)对照组0．60±0．09—0．00010．57±0．116．5±3．90．0010．56±0．117．0±6．30．010．56±0．116．7±5．40．10．44±0．0926．0±6．410．32±0．0747．2±3．3100．09±0．0184．7±0．51000．07±0．0288．5±1．3

图1 不同浓度吡柔比星对MG-63细胞的生长抑制作用

2.2 吡柔比星对MG-63细胞的放射增敏作用 IC10浓度吡柔比星作用于MG-63细胞24 h后联合不同剂量X线照射，细胞存活曲线图可见，通过分析多靶单击模型表明：单纯照射D0、Dq和SF2值分别为2.51Gy、2.42Gy、0.79，吡柔比星作用24 h后照射D0、Dq和SF2值分别为1.69Gy、2.29Gy、0.76，増敏比为1.49(D0比)、1.06(Dq比)、1.04(SF2比)，表明吡柔比星对MG-63细胞有一定的增敏作用，且高剂量照射增敏效果佳。线性二次模型的结果显示：骨肉瘤的α、β和α/β值分别为0.067、0.030和2.23，吡柔比星作用后α、β和α/β值分别为0.017、 0.064和0.27。α/β值较吡柔比星作用前减小。见图2、3。

图2 吡柔比星对MG-63细胞放射敏感性的影响(多靶单击模型)

图3 吡柔比星对MG-63细胞放射敏感性的影响(线性二次模型)

2.3 吡柔比星作用后最佳照射时间 吡柔比星加照射组与单纯照射组比较，细胞存活分数降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且吡柔比星作用不同时间后照射组间比较差异有统计学差异(P<0.05)，吡柔比星对MG-63细胞作用36 h后照射细胞存活分数最低，表明吡柔比星对MG-63细胞的放射增敏效果与药物作用时间呈正相关性(r=0.962，P<0.05)。见表2。

组别存活分数单纯照射12．86±1．07吡柔比星12h+照射组5．67±0．44∗吡柔比星24h+照射组3．37±0．31∗#吡柔比星36h+照射组0．52±0．08∗#△

注：与单纯照射组比较，*P<0.05；与吡柔比较12 h+照射组比较，#P<0.05；与吡柔比星24 h+照射组比较，△P<0.05

3 讨论

多年来随着多种化疗药物相继应用于骨肉瘤的治疗，骨肉瘤的生存率逐渐提高达到70%左右[6]。目前治疗骨肉瘤的化疗方案以阿霉素、顺铂、大剂量甲氨蝶呤、异环磷酰胺等多药联合化疗为主。但是大剂量联合化疗带来的不良反应也受到人们的重视，Bacci等[7]对无转移的骨肉瘤患者进行长期随访发现阿霉素造成的心脏毒性和男性不育是化疗的两个主要并发症。相对于阿霉素而言，吡柔比星的心脏毒性则明显较轻。吡柔比星是1979年由日本微生物化学研究所梅泽滨夫(H.Umezawa)等研制开发的新一代蒽环类广谱抗肿瘤抗生素，其化学结构与多柔比星相近，是多柔比星氨基糖部分第4’位OH基上的一个异构体。对癌细胞的作用机制主要是进入细胞内，迅速分布于细胞核，抑制DNA聚合酶α和β，阻碍核酸的合成。药物嵌入DNA的双螺旋链，使肿瘤细胞终止在G2期，不能进行到细胞分裂期，导致肿瘤细胞死亡。Shinozaki等[8]研究表明以吡柔比星为基础的化疗方案比以阿霉素为基础的化疗方案更具优势，对于复发和转移的骨肉瘤吡柔比星也有较好的疗效[9,10]，故吡柔比星常用于骨肉瘤的化疗。

放射治疗是治疗恶性肿瘤的另一有效手段，一般认为骨肉瘤对于放疗不敏感，但是对于某些特殊部位不能手术或手术无法彻底切除或切缘阳性及诱导化疗组织学反应不佳的患者，放射治疗则不可缺少。术前放疗可提高截肢术的成功率，减少肿瘤复发的风险。Anacak等[11]把手术植骨与体外放疗相结合，在22个月的随访期内没有发现局部复发和手术失败，取得了很好的疗效。

随着多种放射增敏药物的发现，多种对放射线不敏感的肿瘤得以获得更好的治疗，目前对吡柔比星在骨肉瘤放射治疗中的作用研究报道较少。本研究在吡柔比星作用于骨肉瘤细胞24 h后对瘤细胞进行不同剂量照射，发现増敏比均>1，表明吡柔比星对骨肉瘤细胞亦有较好的放射增敏作用。分析原因可能为：(1)吡柔比星联合放射使MG-63细胞存活曲线肩区变窄，Dq值变小，在多靶单击模型中Dq变小意味着亚致死损伤修复减少。(2)吡柔比星可将细胞阻滞于G2期，而在细胞周期中由于处于G2/M期的细胞对放射线最敏感，从而促进瘤细胞凋亡，表现出放射增敏作用。本研究同时显示吡柔比星作用于MG-63细胞不同时间后，细胞存活分数逐渐减小，表明吡柔比星的放射增敏作用与作用于肿瘤细胞的时间有关，其机制可能为吡柔比星对细胞周期(主要是G2/M期)阻滞的积累作用增加了肿瘤细胞的放射敏感性。任振泰等[12]研究多西紫杉醇对A549细胞的放射增敏作用发现药物作用24 h后进行X线照射细胞存活分数最低，其后时间延长细胞存活分数则增高。本实验未进行更多分组，吡柔比星作用延长更多时间后细胞存活分数是否会更小有待进一步研究。研究结果提示，在临床中实施骨肉瘤的治疗方案时，吡柔比星与放疗序贯结合可能会使药物在杀伤肿瘤细胞的同时提高放其放射敏感性，进而获得更好的疗效。另外研究表明单次大剂量(>2 Gy)的照射较单次剂量2 Gy的常规照射增敏效果更好，提示临床中可采用大分割放疗。另外，本研究发现药物作用后线性二次模型α/β值变化较大，提示在同步放化疗时吡柔比星化疗方案结束后需注意及时调整放疗剂量及方案，以达到准确的生物有效剂量。

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·消 息·

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本刊编辑部

Studyontheeffectofpirarubicininradiosensitizationofosteosarcomacellsinvitro

XUXinming,WANGLi,LIUMing,etal.DepartmentofRadiotherapy,TheThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effect of pirarubicin in radiosensitization of human osteosarcoma cells (MG-63) in vitro.MethodsMTT was used to measure the inhibitory effect of pirarubicin on MG-63cells at exponential growth phase to determine IC10 as drug concentration of experiment.After MG-63 were treated with IC10 concentration pirarubicin for 24 hours,the cells were given different doses (0,2,4,6,8Gy) of irradiation as well as IC10 concentration paclitaxel for different time points (12h,24h,36h),finally the cell survival fraction (SF) was detected by clone formation analysis method,radiosensitization ratio was calculated by fitting cell survival curve,and the changes of cell survival rate of MG-63 treated by pirarubicin in different time points (12h,24h,36 h) were analyzed.ResultsAfter 24-hour pirarubicin administration,the cell inhibition rate was gradually increased (P<0.01),and the drug toxicity was dose-dependent,with IC10 concentration being 0.004μg/ml.According to D0,Dq and SF2 value,the sensitivity enhancement ratio (SER) of IC10 concentration pirarubicin was 1.49,1.06 and 1.04,respectively,theα/β ratio of MG-63 cells was 2.23,after treated with IC10 concentration pirarubicin,which was 0.27.After treated with IC10 concentration pirarubicin,MG-63 cells

irradiation.The cell survival fraction was gradually decreased with the time prolongation (P<0.01).ConclusionPirarubicin has radiosensitizing effect on MG-63 cells,and the effect is positively correlated to effect time of drug within a certain time.

pirarubicin；osteosarcoma；radiosensitization

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.004

项目来源：河北省医学科学重点研究课题(编号：20120095)

050051 石家庄市，河北医科大学第三医院放疗科

徐袁秋，050051 河北医科大学第三医院放射科；

E-mail：yuanqiuxqian@hotmail.com

R 730.55

A

1002-7386(2014)02-0173-04

2013-07-23)