卵子玻璃化冷冻在体外受精－胚胎移植取精失败周期中的应用

耿 洁，胡玉琴，刘兰兰

(1.中国人民解放军第174医院生殖中心，福建 厦门 361000;2.安徽医科大学，安徽 合肥 230000)

随着玻璃化冷冻技术的临床应用，卵子冷冻技术获得了很大的进展，甚至可以得到与新鲜卵子相同的妊娠率［1］，这样，可以通过卵子的冷冻保存来解决体外受精－胚胎移植(IVF－ET)中因男方因素无法获得精子的问题。本文分析2010年8月至2012年8月，在我院生殖医学中心取卵日取精失败接受卵子冷冻－解冻的5例患者的临床结局，探讨卵子玻璃化冷冻技术在取精失败周期中应用的可行性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 自2010年起我院生殖医学中心对进行IVF－ET治疗中，因取卵日无法获得精子的卵子进行玻璃化冷冻。知情同意书经伦理委员会讨论并通过。5例患者的玻璃化冷冻保存的卵子解冻后进行了显微授精(ICSI)治疗。平均年龄35.4岁，不育时间平均5.8年。均因男方因素取卵日无法获得精子进行全部的卵子冷冻保存。

1.2 卵子冻融方法 冷冻液分为平衡液和冷冻液，4℃保存，使用前取出室温(25℃)平衡30 min。将卵子置于ES表面，室温下放置，卵子自然下沉，出现皱缩再回复，当卵子膨大到最大程度时(至少回复80%)，迅速用巴氏吸管取出卵子。整个过程大约5 min，一般不超过15 min;然后将其放入VS，在VS中3个不同的位置用吸管进行吸放，时间不超过30～60 s，将卵子以最小液滴体积转移至玻璃化冷冻载体上，迅速置入液氮中，标记保存。卵子的复苏液分为1、2、3、4，均由我生殖中心实验室配制。使用前，1在37℃平衡30 min，其他解冻液室温(25℃)平衡30 min。将载体Crytop从液氮中取出，迅速将前端叶片浸入1中，1 min内卵子脱落到1中。将卵子转移至2内，放置3 min，卵细胞部分恢复至冷冻前形态，但仍未恢复至冷冻前形态。再将卵子依次置于3和4中各5 min，卵子形态将完全恢复，然后转入培养液中培养。对所有解冻后的卵子均采用ICSI方式进行授精。

2 结果

5例患者均解冻了取卵日实施全部冷冻保存的卵子。共复苏卵子 35枚，存活 24枚，复苏率68.57%;有24枚MⅡ卵子行ICSI，受精22枚，受精率91.67%;形成19枚胚胎，卵裂率86.36%，获可用胚胎16枚。5个移植周期移植胚胎13枚，临床妊娠 2例，分娩 2个健康婴儿，胚胎种植率15.38%，活产率40%。剩余冷冻胚胎3枚。

3 讨论

玻璃化冷冻技术是一门新兴技术，其基本原理是细胞及其保护剂溶液以足够快的降温速率，由液态转化为外形类似玻璃状的非晶体化固体状态，由于玻璃化液在低温时黏稠度变得很高而不结晶，形成形态不规则的玻璃样固体，并保留了细胞内外液体正常的分子和离子分布，从而避免产生冷冻损伤［2］。细胞在冷冻过程中容易形成冰晶，损伤细胞膜及细胞内结构，对细胞造成致命的伤害，而玻璃化冷冻就可以很好地解决这一问题。

随着1998年首次用玻璃化冷冻人类胚胎并获成功妊娠，玻璃化冷冻被广泛应用于胚胎及卵子的冷冻。卵子冷冻为女性患者保存生育力提供了最大希望，也为临床特殊病例提供了保障。目前卵子玻璃化冷冻保存技术被认可，近年在临床上也开始逐步应用。Cobo等［3］对照分析研究了2005～2009年的4282枚玻璃化冷冻卵子、3524枚新鲜卵子和361枚慢速冷冻的卵子，结果显示玻璃化冷冻复苏卵子在受精率、胚胎形成率及妊娠率与新鲜卵子相似，比慢速冷冻的卵子生存率及受精率高。Smith等［4］通过前瞻性对照研究发现玻璃化冷冻与程序化冷冻比较，复苏率、临床妊娠率有显著的差异。稳定成熟的卵子冷冻技术是临床应用的前提，本中心只获得了68.57%的复苏率，可能与经验不足有关，但是获得了一定的妊娠率，避免了过去因取卵日取精失败而丢弃卵子的现象。

近年卵子玻璃化冷冻应用取得了显著成效，但技术的有效性仍需评价，尤其是高浓度冷冻保护剂的影响和标本直接与液氮接触带来的污染问题，还有冷冻技术本身带来的一定遗传风险都决定今后研究方向应为冷冻方法的优化与安全性。对936例［5］通过卵子冷冻保存出生的婴儿调查显示，其中392例玻璃化冷冻，532例通过慢速冷冻，均未增加出生缺陷风险。Wennerholm等［6］发现玻璃化冷冻卵子出生的221例孩童与正常出生体重无差异。有限的资料提示是安全的，但还需要进一步的研究［7］。从我们目前的初步研究来看，卵子的玻璃化冷冻保存可以获得一定的临床妊娠率［8］，对IVF－ET治疗中取精失败患者可以作为临床治疗的一个供选择的方法。

［1］ Cil AP，Seli E.Current trends and progress in clinical applications of oocyte cryopreservation［J］.Curr Opin Obstet Gynecol，2013，25(3):247－254.

［2］ Tao T，Del Valle A.Human oocyte and ovarian tissue cryopreservation and its application［J］.J Assist Reprod Genet，2008，25(7):287－296.

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［4］ Smith GD，Serafini PC，Fioravanti J，et al.Prospective randomized comparison of human oocyte cryopreservation with slow－rate freezing or vitrification［J］.Fertil Steril，2010，94(6):2088－2095.

［5］ Noyes N，Porcu E，Borini A.Over 900 oocyte cryopreservation babies born with no apparent increase in congenital anomalies［J］.Reprod Biomed Online，2009，18(6):769－776.

［6］ Wennerholm UB，Sderstrm－Anttila V，Bergh C，et al.Children born after cryopreservation of embryos or oocytes:A systematic review of outcome data［J］.Hum Reprod，2009，24(9):2158－2172.

［7］ Noyes N，Reh A，McCaffrey C，et al.Impact of developmental stage at cryopreservation and transfer on clinical outcome of frozen embryo cycles［J］.Reprod Biomed Online，2009，19(Suppl 3):9－15.

［8］ 贺贞，朱明辉，杨丹.不同来源精子行体外受精/卵胞浆内单精子显微注射所得胚胎冻融及移植后妊娠结局比较［J］.实用医院临床杂志，2010，7(1):41－43.