骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养在组织工程化软骨中的研究进展

江祖炘，谭 波，代 辉 综述，王 跃△ 审校

(1.泸州医学院研究生学院2011级，四川 泸州 646000;2.四川省医学科学院·四川省人民医院骨科，四川 成都 610072)

理论上讲，自体软骨细胞作为种子细胞修复软骨缺损是较为理想的，但由于软骨细胞属于增殖能力极弱的终末细胞，传代能力也十分有限，易出现去分化现象;同时，来源广、分化能力强的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为种子细胞近年研究较多，但由于定向分化比较复杂和不稳定，分化后形成的软骨细胞易出现退化和衰老，因此单独的软骨细胞和单独的BMSCs在组织工程软骨应用中皆受限。国内外有文献报道将BMSCs和软骨细胞共同培养，使两种细胞优势互补，为优化和扩大组织工程化软骨种子细胞源提供了可能。本文就BMSCs和软骨细胞共培养的原理、方法和存在的问题加以综述，为BMSCs和软骨细胞共培养作为种子细胞进一步的研究提供理论依据。

1 BMSCs和软骨细胞共培养成软骨分化原理

成熟软骨细胞能分泌含TGF－β1的一系列成软骨生长因子，而TGF－β1为诱导BMSCs向软骨细胞转化的关键物质。Liu等［1］通过猪BMSCs和关节软骨细胞共培养，观察到软骨细胞能分泌TGF－β1、IGF－1等因子并有新生软骨样组织形成，说明软骨细胞可以诱导BMSCs向软骨细胞转化。而王结果等［2］发现 BMSCs以旁分泌或自分泌的方式调节BMSCs向软骨细胞分化，进一步完善了共培养的原理。李拉等［3］则认为BMSCs有成软骨分化现象，但并不明显，而其促进软骨细胞增殖的作用可能在共培养中起主导作用。可以看出BMSCs和软骨细胞共培养成软骨分化原理除了成软骨生长因子外，细胞间的相互作用也不容忽视。

2 BMSCs和软骨细胞共培养方法

2.1 接触共培养 接触共培养也称混合共培养，为共培养的一种方法，将一定比例的两种细胞混合在一起，相互接触，最终诱导BMSCs向软骨细胞分化。冯万文等［4］利用兔自体BMSCs与软骨细胞接触共培养后与脱钙骨基质复合能有效修复关节软骨缺损。说明BMSCs能增强软骨细胞的增殖，促进软骨细胞基质合成，缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数，可节省大量的软骨细胞。正常成熟软骨细胞能提供成软骨环境，而人骨关节炎时软骨细胞分泌的骨成形素也能成功诱导BMSCs向软骨细胞分化［5］。Wu等［6］的报道则明确说明了接触共培养中软骨细胞提供了BMSCs向软骨细胞分化的必要条件，而与BMSCs转化而来软骨细胞无关。这可能是新生软骨细胞还处于细胞早期，细胞功能不全。同时，Fischer等［7］通过接触共培养发现人关节软骨细胞通过分泌甲状旁腺激素相关蛋能还能抑制BMSCs的过度分化。但也有研究认为软骨细胞对BMSCs的诱导作用仅限于新生软骨的形成，而对于软骨细胞外蛋白多糖的聚集和抑制BMSCs过度分化没有作用［8］。

2.2 隔离共培养 隔离共培养是共培养中的另一种方法，将一定比例的两种细胞放在一起，但不接触，细胞间只有培养液的交换。田力等［9］在体外用含直径0.22 μm孔的通透膜将兔BMSCs和软骨细胞隔离共培养，观察到软骨微环境在BMSCs向软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用，软骨细胞能有效地诱导BMSCs向软骨细胞分化并促进BMSCs体内软骨形成。而 Acharya等［10］则通过 Traswell(插入式细胞培养皿，是一类有通透性的杯状装置)小室共培养人BMSCs和关节软骨细胞，得出两种细胞间有相互作用，BMSCs可以诱导软骨细胞增殖，软骨细胞可以诱导BMSCs向软骨细胞分化的结论。对于软骨组织形成关键的细胞外基质而言，王万宗等［11］的研究证明氨基聚糖含量随着诱导时间增加而增多，提示关节软骨细胞分泌物具有促进BMSCs向关节软骨样细胞转化的能力。而周峰等［12］的研究则说明软骨细胞同样能诱导老年人BMSCs向成软骨细胞转化。

3 不同诱导方法的比较

3.1 接触共培养与隔离共培养比较 为比较两种方法的优劣，Bian等［13］用人 BMSCs和软骨细胞分别用两种方法培养，最终发现接触共培养比隔离共培养产生的软骨组织具有更强的生物力学。细胞间的相互接触促进细胞外基质的产生，从而使生成的软骨组织更接近于正常软骨组织。但隔离共培养更适合于观察细胞各自的变化，是研究共培养原理的理想方法。

3.2 共培养与传统成软骨诱导液比较 有学者将共培养诱导形成的软骨样组织和传统的含TGF－β1等诱导因子诱导的软骨样组织进行比较。Lettry等［14］利用马BMSCs和软骨细胞共培养，发现BMSCs能向软骨细胞分化，加入TGF－β1后并没有提高软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因的表达。吕晶等［15］发现采用共培养方式诱导的软骨细胞，其生物学特性与采用含TGF－β1的条件培养液诱导的软骨细胞相比，前者优于后者，如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。陈宗雄等［16］也发现共培养诱导的结果与含10 μg/L TGF－β1的诱导液结果相当，但随着关节软骨细胞在诱导体系中比例的增加，诱导结果明显优于TGF－β1诱导，但这种诱导作用也存在饱和现象。或许是成熟的软骨细胞能提供和体内更为相似的环境，所以共培养形成的软骨组织细胞外基质较多。

4 BMSCs和软骨细胞共培养中存在的问题

4.1 两种细胞的最佳比例 两种细胞的比列是共培养结果的关键，不同比列的两种细胞共培养后可以得到性状不同的新生软骨组织，但哪种比列最好，目前还没有统一的观点。Tsuchiya等［17］研究说明软骨细胞的增殖速度和细胞外基质的合成与BMSCs的比例呈正相关，但没有给出明确比列。Kang等［18］用猪 BMSCs和软骨细胞接触共培养，发现BMSCs和软骨细胞为5∶5时Ki67和Dlk1两种关于细胞增殖和成软骨潜能的基因含量较其他组高。而Qing等［19］则报道2∶1(兔BMSCs:兔软骨细胞)组Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖含量显著高于其他比例组。蒋恺等［20］将混合后的细胞依次体外及体内培养，观察到BMSCs与软骨细胞混合浓度比例以3∶1最好。不同的细胞比例对新生软骨组织的特性影响较大，最佳比例还需进一步研究。

4.2 细胞种植密度、诱导时间和支架的选择 细胞种植密度也是诱导向软骨细胞分化的关键。一般认为较高密度的细胞培养有利于细胞与细胞、细胞与基质间相互作用以及细胞之间的信号传递，并能形成低氧浓度的环境，有利于诱导成软骨细胞。并且高密度的细胞共培养可以延长所培养的细胞维持表型不变的时间［21］。而诱导时间和支架材料的选择性较大，目前还很难判断哪个最好。吴俊等［22］将5.0×107/ml终浓度的混合细胞接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架上体外培养8周，然后裸鼠体内再培养6周，证明软骨细胞能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。Meretoja等［23］用 1.25×106/ml终浓度的混合细胞接种于聚甲基丙烯酸甲酯(PCL)支架上体外培养8周，同样得出软骨细胞能够诱导BMSCs向软骨细胞分化，并且干细胞能提高软骨细胞潜能。不同的种植密度，不同的诱导时间以及支架等的选择都会影响软骨组织的形成，不同因素的单独作用及相互间的作用等都还有待研究。

5 小结与展望

BMSCs和软骨细胞作为种子细胞都有各自的优势和不足，BMSCs和软骨细胞共培养，取其两种细胞优点，并相互弥补不足，为组织工程化软骨种子细胞来源的有效方法。并通过与传统的含TGF－β1的诱导液比较得出共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞，更有利于作为组织工程软骨的种子细胞并且实验费用也较低，因此BMSCs和软骨细胞共培养与传统的条件诱导液相比占有一定的优势［24］。但目前仍存在一些问题，共培养原理还需完善，共培养的方法还在不断更新，以及两种细胞的最佳比例、共培养的时间、细胞种植密度、三维支架材料的选择等问题仍需要进一步探索。随着科学技术的发展，我们充分相信BMSCs和软骨细胞共培养在组织工程化软骨的发展过程中具有广阔的应用前景。

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